他莫昔芬對人肝癌細胞增殖及凋亡的影響

林　松　江　平　喬建國

（武漢大學 中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071）お

摘 要：目的：研究他莫昔芬對人肝癌細胞Hep3B增殖、凋亡以及雌激素受體（ER）表達的影響。方法：按他莫昔芬濃度分別為7.5、15、30mol/L分為3組，對照組為空白培養(yǎng)基，每組設10個平行孔，每孔加入細胞濃度為1×105個/mL的細胞懸液0.1mL，分別培養(yǎng)24、48及72h。采用MTT法測定OD值，計算細胞增殖抑制率；用RT-PCR方法在mRNA水平檢測p21WAF1以及流式細胞術來觀察細胞凋亡情況；用免疫組化方法觀察他莫昔芬對Hep3B細胞雌激素受體表達的影響。結果：他莫昔芬抑制人肝癌細胞Hep3B增殖（P<0.05），并隨其濃度及處理時間的增加而抑制率增加；他莫昔芬提高細胞凋亡率；他莫昔芬抑制雌激素受體的表達（P<0.05），促進p21WAF的表達。結論：他莫昔芬通過影響肝癌細胞ER和p21WAF的表達抑制肝癌細胞增殖。

關鍵詞：肝癌；他莫昔芬；雌激素受體；凋亡；p21WAF

中圖分類號：R735.7文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）03-0007-03

他莫昔芬（tamoxifen，TAM）又稱為三苯氧胺，為非甾體類雌激素受體拮抗劑，此前主要應用于成人乳腺癌的預防及治療，在肝癌的治療上有一定的療效，但存在很多爭議^[1]。本課題通過觀察人肝癌細胞Hep3B細胞在他莫昔芬作用前后增殖活性和細胞凋亡情況的變化，雌激素受體（ER）陽性表達以及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（CKI）之一p21WAF基因水平表達的變化，來研究他莫昔芬在肝癌治療中的可行性及可能的作用機制。

1 材料及方法

1.1 材料

人肝癌細胞Hep3B由武漢大學基礎醫(yī)學院病毒學研究所提供；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；試驗用他莫昔芬，即用型鼠抗人ER單克隆抗體及MTT購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；青霉素購自華北制藥公司；RT-PCR試驗引物由上海生工合成，SP試劑盒及聯(lián)苯二胺顯色劑購自福州邁新生物技術公司。

1.2 方法

（1）細胞培養(yǎng)。將人肝癌細胞Hep3B細胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中（加入10%胎牛血清及濃度為100U/mL的青霉素），置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中。

（2）分組。按他莫昔芬濃度為7.5、15、30μmol/L分為3組，對照組不加入他莫昔芬，每組設10個平行孔。

（3）MTT試驗。取培養(yǎng)穩(wěn)定的對數生長期Hep3B細胞，用1640培養(yǎng)基調節(jié)細胞濃度為1×105個/mL，加入96孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1mL，置入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中24h，鏡下觀察細胞大部分貼壁后，棄去培養(yǎng)液分別加入含不同濃度他莫昔芬的培養(yǎng)液每孔各0.1mL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72h，然后每孔加入MTT10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩約15min，于492nm讀取OD值，并計算抑制率。抑制率（%）=（1-試驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

（4）ER免疫組化染色。將蓋玻片置入六孔板的培養(yǎng)孔，取對數生長期的細胞傳代后加入培養(yǎng)孔中，加入含不同濃度他莫昔芬的培養(yǎng)液，置入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72h后，將蓋玻片放入4℃甲醇∶丙酮（1∶1）中約20min固定，用PBS液清洗玻片3×3min，甩干后于每張蓋玻片上滴加50μL的非免疫性動物血清封閉，置入37℃溫箱孵育30min。用SP法進行免疫組化染色，每張蓋玻片上滴加50μL即用型鼠抗人雌激素受體單克隆抗體，4℃過夜，然后每孔加入50μL生物素標記的二抗，37℃孵育1h，每孔加入50μL鏈親和素-過氧化物酶也即三抗，37℃孵育40min，每孔加入聯(lián)苯二胺100μL顯色，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分色，梯度濃度的乙醇液脫水干燥，二甲苯透明處理，最后用中性樹膠封片。

（5）流式細胞儀檢測。使用武漢大學基礎醫(yī)學院Beckmann流式細胞儀對樣品進行檢測。收集經不同濃度他莫昔芬作用24、48、72h的細胞，常規(guī)用胰蛋白酶消化，離心收集后用預冷的濃度為70%的乙醇液固定，-20℃過夜，100μLRNA酶（100mg/L）消化，常規(guī)PI（50mg/L）染色，4℃避光30min后上機檢測，激發(fā)波長為488nm，分析結果后計算凋亡率。

（6）RT-PCR檢測P21WAF1。收集經不同濃度他莫昔芬作用不同時間的細胞，經異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取細胞總RNA。Oligo（dT）18為引物，逆轉錄合成cDNA，然后以合成的cDNA為模板，用P21基因及β-actin內參照進行半定量PCR擴增。實驗條件為：變性94℃ 60s，退火60℃ 60s，延伸72℃ 60s，30個循環(huán)，P21基因擴增帶為316bp，β-actin擴增帶為500bp。引物序列：P21上游引物5-CCACATGGTCTTCCTCTGCTG-3，下游引物5-GATGTCCGTCAGAACCCATG-3；β-actin上游引物5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，下游引物5-CTCCTTAATGCACGCACGATTTC-3。

2 結果

2.1 他莫昔芬對人肝癌細胞增殖的影響

TAM對人肝癌細胞Hep3B的抑制作用隨作用時間延長而不斷增強，24、48、72h組之間相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；隨TAM濃度增加作用也增強，不同濃度TAM組肝癌細胞抑制率均較對照組高（P<0.05），30μmol/L組72h抑制率最高，如表1所示。

2.2 他莫昔芬對人肝癌細胞ER陽性表達的影響

TAM對人肝癌細胞ER陽性表達的抑制作用隨作用時間延長而不斷增強，24、48、72h組ER陽性率下降并有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；不同濃度TAM對ER陽性表達均有抑制作用，且隨濃度增加抑制作用增強，各組肝癌細胞ER陽性率均較對照組明顯降低（P<0.05），30μmol/L組72hER陽性率最低，如表2所示。

2.3 他莫昔芬對人肝癌細胞凋亡的影響

（1）流式細胞儀檢測結果。肝癌細胞的凋亡率隨TAM濃度的增加和作用時間的延長而提高。肝癌細胞生長阻滯于細胞周期的G0/G1期，S期比例減少，細胞增殖指數下降。與對照組比較各組均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），如圖1所示。

（2）RT-PCR檢測結果。P21基因mRNA的表達在TAM作用24h后與對照組比較即有增加，并隨TAM濃度的增高及作用時間的延長而表達進一步增高，30μmol/L組作用72h最為明顯，與肝癌細胞凋亡過程基本一致，如圖2所示。

3 討論

肝癌是一種雌激素依賴型腫瘤，相關研究表明，雌激素水平的上調可導致肝癌發(fā)病率升高^[2]。人肝細胞表達高親和性的ER，而肝癌細胞ER表達較正常肝細胞更高^[3]，雌激素通過ER介導的信號通路來誘導肝細胞基因轉錄水平的變化，從而誘導肝癌的發(fā)生^[4]。此外雌激素尚可通過激活蛋白激酶C來促進人肝癌細胞的增殖^[5]。

TAM為一種非甾體抗雌激素類藥物，其化學結構與雌激素相似，故可在雌激素作用的各人體靶器官內與雌激素競爭ER，減少胞漿內的ER含量，阻止細胞核內雌激素生成基因的轉錄和ER的再合成。TAM還通過作用于信號傳導MAPK通路，阻斷蛋白激酶C，從而激活TGF-β、p21、p27等的表達來抑制腫瘤細胞的生長^[6]，目前已廣泛應用于臨床乳腺癌的預防及治療。

然而將TAM應用于臨床肝癌治療目前尚存在爭議。體外實驗發(fā)現TAM對肝癌細胞增殖有抑制作用，呈時間-濃度依賴性^[7]。本研究發(fā)現，隨著TAM濃度的增加和作用時間的延長，其對肝癌細胞Hep3B增殖的抑制作用不斷增強，以濃度為30μmol/L的TAM作用72h的抑制作用最強，ER的陽性表達率最低，流式細胞儀檢測顯示細胞增殖指數最低，RT-PCR產物電泳顯示p21基因mRNA表達水平最高。實驗的結果說明TAM可以抑制肝癌細胞生長，它通過與雌激素競爭性結合ER，阻斷蛋白激酶C，降低端粒酶活性^[8]，上調p21、p27的表達^[9]，影響Ca2+通路^[10]等來抑制肝癌細胞的增殖及促進其凋亡。

綜上所述，相關研究證明，TAM對人肝癌細胞的增殖有抑制作用，這為TAM應用于臨床肝癌的內分泌治療提供了理論依據，而且因TAM價格較低，易于推廣，故顯示出了很好的應用前景。而雌激素水平對于TAM抑制肝癌細胞增殖的影響尚待進一步研究。

參考文獻：

［1］ CHOW PK， TAI BC， TAN CK， et al.High-dose tamoxifen in the treatment of inoperable hepatocellular carcinoma： A multicenter randomized controlled trial［J］.Hepatology，2002， 36（5）：1221-6.

［2］ CASTRO-RIVERA E， SAFE S. 17 beta-estradiol and 4-hydroxyta- moxifen-induced transactivation in breast， endometrial and liver cancer cells is dependent on ER- subtype， cell and pro-moter context ［J］. Steroid Biochem Mol Biol， 2003， 84（1）： 23231.

［3］ HAMAZAKI K， MIURA H， SAKAI H，et al. Estrogen and androgen receptors in hepatocellular carcinoma and in noncancerous liver tissue［J］.Gan No Rinsho. 1989, 35（10）：1109-13.

［4］ WAALKES MP， LIU J， CHEN H， et al. Estrogen signaling in livers of male mice with hepatocellular carcinoma induced by exposure to arsenic in utero ［J］. J Natl Cancer Inst， 2004， 96 （6）：4662474.

［5］ MARINO M， DISTEFANO E， CAPORALI S， et al. Beta-estradiol stimulation of DNA synthesis requires different PKC isoforms in HepG2 and MCF7 cells ［J］. J Cell Physiol， 2001， 188 （2）：1702177.

［6］ LIANG Y， HOU M， KALLAB AM. Induction of antiproliferation and apoptosis in estrogen receptor negative MDA2231 human breast cancer cells by mifepristone and 4-hydroxytamoxifen combination therapy： a role for TGF2beta1［J］. Int J Oncol， 2003， 23（2）：3692380.

［7］ BRANDT S， HELLER H， SCHUSTER KD， et al. Tamoxifen induces suppression of cell viability and apoptosis in the human hep-atobl astoma cell line HepG2 via down2regulation of telomer2 ase activity［J］. Liver Int， 2004， 24（1）：46254.

［8］ BRANDT S， HELLER H， SCHUSTER KD， et al. The tamoxifen-in- duced suppression of telomerase activity in the human hepa- toblastoma cell line HepG2： a result of post-translational regulation［J］. J Cancer Res Clin Oncol， 2005，131（2）：1202128.

［9］ CEHN J， WILLINGHAM T， SHUFORD M， et al. Effect of ectopic overexpression of p21 （WAF1/CIP1） on aneuploidy and the m alignant phenotype of human brain tumor cells［J］. Oncogene， 1996，13： 1395-1403.

［10］ KIM JA， KANG YS， JUNG MW， et al. Involvement of Ca2+influx in the mechanism of tamoxifen-induced apoptosis in HepG2 human hepatoblastoma cells［J］. Cancer Lett， 1999， 147 （122）：1152123.

（責任編輯：陳涌濤）