雞囊胚細胞玻璃化冷凍保存技術的研究

摘要:研究不同冷凍液配方對雞囊胚細胞的玻璃化冷凍保存效果。對新鮮種蛋囊胚細胞分離提純后，在DMEM中添加不同的冷凍保護劑DMSO(二甲基亞砜)、EG(乙二醇)、蔗糖，分別組成6種玻璃化冷凍保護液，進行超低溫冷凍保存。復蘇后通過苔盼藍染色測定活細胞存活率。結果:玻璃化冷凍保存中，囊胚細胞在玻璃化冷凍液配方2(10%EG+10%DMSO+0.5mol/L蔗糖+20%FBS+DMEM)條件下復蘇后存活率最高(71.32%)，與玻璃化冷凍液配方1和3條件下復蘇后存活率之間差異顯著(P<0.05)，且與玻璃化冷凍液配方4、5、6條件下復蘇后存活率之間差異均極顯著(P<0.01)，可以作為雞囊胚細胞的玻璃化冷凍液。

關鍵詞:雞;囊胚細胞;玻璃化冷凍

中圖分類號:S831.4+9文獻標識碼:A文章編號:1007-273X(2009)11-0007-03

隨著超低溫冷凍保存技術的發展，許多哺乳動物及一些瀕危動物的種質細胞(精子、卵子和胚胎)都實現了超低溫冷凍保存，玻璃化冷凍技術因其簡便、快速、經濟，減輕了胚胎冷凍中常見的凍傷現象，存活率提高，因此應用日益廣泛[1]。本實驗采用玻璃化冷凍雞X期囊胚細胞，并探討此方法對雞胚胎復蘇效果，為家禽種質資源保存做基礎性研究。

1材料和方法

1.1實驗時間和地點

實驗時間:2009年2月至2009年4月。

實驗地點:湖南省畜牧獸醫研究所生物技術研究室。

1.2材料

1.2.1種蛋種蛋來自湖南省畜牧獸醫研究所生物技術研究室飼養的白萊航雞。

1.2.2主要試劑DMEM(高糖，Gibco)、FBS(胎牛血清，杭州四季青公司生產)、DMSO(二甲基亞楓，Sigma)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮，Sigma)、EG(乙二醇，Sigma)、Sucrose(蔗糖，Sigma)。

1.3方法

1.3.1雞囊胚細胞的采集[2]在無菌環境中，將已消毒的種蛋打入培養皿中，使胚盤位置位于正上方。剪破并刮除胚盤上的濃蛋清，用消毒后的濾紙環輕輕貼在囊胚的位置，將粘有囊胚的濾紙環轉入含PBS的培養皿。用頭發環剔除蛋黃，切掉周圍的暗區，保留中央的明區，再用 0.5% PBS清洗兩次后待用。

1.3.2囊胚細胞玻璃化冷凍液和復蘇液的配制冷凍液和復蘇液的配制方法參考韓威等冷凍和復蘇PGCs細胞的液體配制方法[3]。囊胚細胞慢速冷凍液由細胞懸液I和細胞懸液Ⅱ共同組成。細胞懸液I:DMEM+20%FBS;細胞懸液Ⅱ:無血清DMEM+冷凍保護劑(其中不同配方中，EG、DMSO和蔗糖的比例不同)。不同玻璃化冷凍液配方見表1。

1.3.3冷凍方法將PBS清洗過的囊胚細胞放入細胞懸液I中懸浮，輕輕吹打，同時緩慢加入等體積的細胞懸液Ⅱ，使其混合均勻。調整細胞密度為2～3×10⁷個/mL，開始裝管。采用0.25mL精液細管裝胚，按順序依次吸入0.5mol/L蔗糖溶液(5cm)，首先抽取細胞懸液Ⅱ2.5～3.0cm，然后抽吸1.5～2.0cm空氣柱。之后抽吸含胚胎的玻璃化冷凍液1.5～2.0cm，盡量使胚胎位于溶液中段。再抽吸1.5～2.0cm空氣柱。最后抽吸細胞懸液Ⅱ至冷凍麥管末端，用電加熱鑷子封閉麥管。隨即浸入液氮中冷凍保存。

1.3.4復蘇方法復蘇液的配制:1.5mL離心管中加入1mL無血清DMEM液，再緩慢加入0.2mL FBS于離心管底部，制得解凍液，可見明顯的分層，使用前37～38℃預熱。

囊胚細胞復蘇時，從液氮罐取出冷凍麥管，迅速投至37～38℃水浴中放置10s，用無菌剪刀剪開麥管兩端，用注射器將冷凍麥管內胚胎緩慢的吹入復蘇液的上層面，當細胞下沉到DMEM和FBS液面分界處，1 000r/min離心5min收集囊胚細胞沉淀，用細胞培養液懸浮囊胚細胞沉淀。

1.3.5細胞活率計算培養液中的懸浮囊胚細胞，轉入6孔培養板中，細胞密度為2~3×104個/孔。37℃，5%CO2，飽和濕度條件下于CO2培養箱中培養2h后，采用臺盼藍對囊胚細胞進行染色后，計數染色的死細胞數和未染色活細胞數，并計算細胞存活率，以同期未冷凍的雞囊胚細胞作為對照。

1.3.6形態學鑒定用倒置顯微鏡，觀察培養4h后的囊胚細胞生長、集落形成情況及集落的外部特征。

1.3.7數據處理實驗結果用SAS V8.01統計分析軟件進行數據處理，檢驗方法采用X2檢驗。

2結果與分析

2.1細胞活率和臺盼藍染色結果

采用不同玻璃化冷凍液冷凍，復蘇后囊胚細胞的存活率結果見表2，從表2可以看出，囊胚細胞玻璃化冷凍復蘇后，在冷凍保護液1和冷凍保護液3條件下的活率分別為65.65%、61.75%，兩者之間差異顯著(P<0.05);冷凍保護液2條件下的活率為71.32%，與冷凍保護液1和冷凍保護液3條件下的活率相比，差異極顯著(P<0.01);同時發現，囊胚細胞復蘇后在冷凍保護劑4、冷凍保護劑5和冷凍保護劑6條件下的活率分別為:35.73%、36.78%和30.31%，與前3種保護液(1、2和3)相比，差異極顯著(P<0.01);而冷凍保護劑4和冷凍保護劑5條件下活率之間差異不顯著(P>0.05);而冷凍保護劑6與冷凍保護劑4、冷凍保護劑5相比，差異顯著(P<0.05)。復蘇后囊胚細胞采用臺盼藍染色計算存活率(見圖1)。

2.2形態學觀察結果

復蘇后的囊胚細胞采用加蓋玻片方式接種培養，6h后觀察到部分細胞呈現貼壁狀。此時已表現貼壁特征的囊胚細胞開始相互融合。玻璃化冷凍復蘇后的囊胚細胞培養8h內，仍具有較好的活性(見圖2)。

3討論

家禽遺傳物質的保存形式主要有:①活體保存。②精液冷凍保存。③DNA的保存(cDNA文庫、核苷酸序列數據庫等)。④胚胎冷凍保存。其中，活體保存形式是禽類遺傳物質保存的最可靠方式，但受資金、近交衰退和地方性疾病等因素的限制;精液冷凍保存，作為一種有效的種質細胞保存方式，僅是保存了成年公禽的基因組，而且復蘇后精液受精率較低(50%～70%);以DNA形式保存的遺傳物質，只是特定基因或整個基因組的一小部分;而禽類受精卵體積較大、結構和組分復雜、抗凍能力較弱且含有大量卵黃，難以實現冷凍保存。由于禽類生殖系統的特殊性，當雞蛋產出體外時，雞胚已經是擁有內外胚層的囊胚期細胞團(即X期囊胚)。1996年Pain等首次系統地闡述了X期囊胚含有潛在的禽胚胎干細胞，而用于轉基因操作的PGCs細胞(原生殖細胞)來源于X期囊胚明區的中央帶細胞群。X期細胞可以作為外源基因的載體，在嵌合體制備、轉基因動物生產等研究中具有良好的應用前景。因此，應用玻璃化冷凍技術研究家禽X期囊胚細胞的冷凍保存方法，為禽類遺傳資源多樣性保存提供另一種可靠途徑，同時也可以為囊胚細胞的體外遺傳操作提供細胞來源。

玻璃化冷凍的基本原理是在細胞冷凍過程中添加高濃度的冷凍保護劑，固化脫水后直接投入液氮中，通過快速降溫，形成玻璃態，避免胞內外冰晶損傷，并以這種玻璃態在低溫下保存。玻璃化冷凍保存雖然在低溫保存技術和低溫生物學研究中起步較晚，但由于其良好的冷凍效果和潛在的發展前景而倍受關注，進展較快。

本研究用封閉的麥管玻璃化法冷凍保存雞胚，和以往的慢速冷凍方法一樣，胚胎和液氮完全隔離。囊胚細胞玻璃化冷凍的最低復蘇率能達到57.73%，而最高復蘇率達到了70.32%，證明冷凍劑配方是可行的。但與韓威等[3]研究的PGCs玻璃化冷凍復蘇率比較略低，究其原因可能有如下幾個:①冷凍程序的影響。細胞在玻璃化冷凍液中，平衡時間如果過短，冷凍劑滲透不足，會導致細胞內脫水不充分而形成內源冰晶，而如果時間過長，高濃度的冷凍保護劑又會對細胞產生毒性。在哺乳動物胚胎、卵母細胞的玻璃化冷凍方法[4~8]中，一般采用將冷凍物在常溫下，依次放入濃度逐漸升高的玻璃化冷凍液稀釋液中平衡，以達到固化脫水、避免高濃度冷凍液損傷的目的。因此本研究在玻璃化冷凍程序中，對平衡過程加以改進:在待冷凍雞囊胚細胞懸浮處理過程中，分步加入細胞懸液Ⅰ和細胞懸液Ⅱ，混合形成最終濃度玻璃化冷凍液，此過程是囊胚細胞在冷凍劑濃度逐漸升高，最后達到最終濃度的玻璃化冷凍液中連續平衡的過程，目的在于保證冷凍劑DMSO和EG能夠充分進入細胞內，由于溫度較低，DMSO、EG對細胞的毒性也較低。雖然冷凍保護劑參考了韓威等針對禽類細胞的玻璃化冷凍液配制方法，但冷凍方法操作上，對裝管過程中冷凍保護劑與囊胚細胞的接觸時間和接觸劑量較難控制。同時裝管后的快速投入液氮降溫，產生的“爆沸”情況，對冷凍效果有一定影響。②冷凍液的毒性和形成玻璃化能力的影響。玻璃化冷凍液的毒性和玻璃化能力，與其組成和濃度有關，本試驗采用滲透性冷凍保護劑DMSO、EG單獨或聯合與非滲透性冷凍保護劑蔗糖組成玻璃化冷凍液。從試驗結果看，玻璃化冷凍液2(10%DMSO+10%EG+0.5mol/L蔗糖)保護效果最好，表明DMSO、EG以及蔗糖對囊胚細胞是有效的玻璃化冷凍保護劑。冷凍液1與3、4與6相比，差異顯著(P<0.05)或差異極顯著(P<0.01)，說明EG對囊胚細胞的玻璃化冷凍保護效應顯著強于DMSO，高濃度的DMSO(20%)對囊胚細胞有一定毒性。而冷凍液2與1、3相比差異極顯著，表明在高濃度的滲透性冷凍保護劑條件下，DMSO和EG的聯合(10%+10%)在雞PGCs細胞的玻璃化冷凍中起到了互補作用，既降低了DMSO在玻璃化冷凍液中的濃度，降低對細胞的毒性作用，又可以增強玻璃化形成能力。同時比較冷凍液1、2、3和4、5、6，發現低濃度的滲透性冷凍保護劑對囊胚細胞玻璃化冷凍保護不夠，可能的原因是濃度低時玻璃化形成能力降低。③復溫程序產生的影響。在胚胎、卵母細胞[4-8]等玻璃化冷凍復蘇方法中，一般采用將復溫后的冷凍物依次移入濃度逐漸降低的解凍液中稀釋洗滌，除去高濃度的冷凍保護劑。本試驗中復溫后的囊胚細胞從解凍液上層面緩慢注入，細胞下沉至DMEM和FBS分界面處，這個過程是連續稀釋洗滌的過程，既可以移出冷凍保護劑，又可以避免細胞內外滲透壓的急劇變化，而分界面下層的FBS有助于復蘇后PGCs細胞形態和功能的恢復[9]，對細胞的復蘇有一定的促進作用。

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