馬鈴薯莖尖脫毒組織培養技術研究綜述

楊小琴 李善才 李增偉 胡曉燕 孫利軍

摘要綜述了近幾年來馬鈴薯莖尖脫毒技術的研究進展,從馬鈴薯生產概況及危害馬鈴薯的主要因素、莖尖剝離發展歷史及原理、莖尖脫毒技術要點、影響馬鈴薯莖尖脫毒效率的因素方面作了概述并對其發展前景進行了展望,以為馬鈴薯莖尖脫毒技術發展奠定基礎。

關鍵詞馬鈴薯;莖尖;脫毒;組織培養

中圖分類號S532文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)22-0085-02

ReasarchReviewOn Virus-freeTechnology ofPotatoStep-tip Tissue Culture

YANG Xiao-qinLI Shan-caiLI Zeng-weiHU Xiao-yanSUN Li-jun

(Yulin Institution of Agricultural Sciences,Yulin Shaanxi 719000)

AbstractIn the paper,the recent studies on step-tip tissue culture of potato were reviewed. The respects about potato production situation,factors of potato production,historical development, theory and outline of virus-free on step-tip,and influencing factors on virus-free on step-tip tissue culture were summaried.Then the development prospect was presented so as to lay a foundation for the development of potato step-tip virus-free tissue culture.

Key wordspotato;step-tip;virus-free;tissue culture

馬鈴薯栽培分布較廣,世界上共有148個國家栽培,主要分布在歐洲和亞洲。據聯合國糧農組織資料統計,全世界現有馬鈴薯栽培面積為1 838.1萬hm2,總產量29 511.8萬t,平均單產16t/hm2[1,2]。我國是馬鈴薯種植大國,種植總面積逾460萬hm2,是世界上最大的馬鈴薯生產國[3,4]。預計到2010年,我國馬鈴薯種植面積將達到600萬hm2,屆時我國馬鈴薯產量將達到1.8億t。近年來,隨著我國農業產業結構調整和種薯、商品薯、加工企業市場的發展,優質馬鈴薯加工產品供不應求,加工用薯比例大幅度增加,馬鈴薯栽培正成為種植業結構調整和農民增收的一項戰略選擇,而馬鈴薯種植逐步走向規模化、標準化、區域化[5]。

但在馬鈴薯連年的栽培過程中,由于病毒或類病毒的侵染和積累,造成馬鈴薯質量退化和產量下降,因而栽培無病毒植株具有重要的生產價值。解決馬鈴薯退化,獲得無病毒植株的途徑有自然選擇、物理學方法、化學藥劑處理、生物學方法等。其中最行之有效的方法便是生物學方法中的莖尖脫毒。該文就馬鈴薯的莖尖脫毒及影響其脫毒效果的技術措施進行了綜述,以期為生產優質脫毒苗,保證種薯源頭質量提供參考。

1馬鈴薯產業現狀及危害其生產的主要因素

栽培種的馬鈴薯(Solanum tuberosum L.,2n=48)是雙子葉種子植物,屬茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)一年生喜涼草本植物[6]。又名洋芋、土豆,原產南美洲,在我國已有300多年的栽培歷史。馬鈴薯生育期短,產量高,營養豐富,是典型的糧菜兩用型作物,是我國四大栽培作物之一。

世界馬鈴薯面積分布的最大特點是以歐、亞兩洲種植為主,兩者種植面積占世界馬鈴薯總面積的78%,其中中國、俄羅斯、烏克蘭、印度四大生產國占世界種植面積的1/2[7]。而馬鈴薯的發源地南美洲種植面積只占世界馬鈴薯總面積的5%。除整個美洲大陸保持相對穩定外,歐洲的種植面積在持續減少,而亞洲、非洲的種植面積在不斷增加。馬鈴薯在生產上絕大多數是利用塊莖進行無性繁殖[4]。國際馬鈴薯中心(CIP)和國際食品政策中心(IFPRI)合作研究表明,到2020年為止,全世界對馬鈴薯的需求將有望增長40%,超過水稻、小麥和玉米的增長。特別是亞洲和非洲對馬鈴薯的需求將增長更快[8]。

馬鈴薯在栽培過程中,植株逐年變小,葉片皺縮卷曲,葉色濃淡不均,莖桿矮小細弱,塊莖變形龜裂,產量逐年下降,這些都表明馬鈴薯已經發生退化。種薯退化是引起產量降低和商品性狀變差的主要原因[9]。據此,科學家從植物生理學、生物化學、栽培技術、栽培環境、種薯貯藏條件、病蟲害侵染等方面對馬鈴薯“退化”進行了深入的研究,研究表明,各種病毒、真菌、細菌等對馬鈴薯的侵染是導致我國馬鈴薯單產較低的主要原因[10-12]。

目前,已知的馬鈴薯侵染病毒約有30種,由于馬鈴薯育種體系尚不健全,農民自留種現象普遍,致使病毒感染面積占到栽培總面積的80%以上。在我國廣大馬鈴薯產區,危害馬鈴薯的5種主要病毒為馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯A病毒和Y病毒(PVA,PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV),以及馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)。其中PVY、PLRV是危害最為嚴重的2類病毒。

2莖尖脫毒技術發展歷史及其原理

馬鈴薯莖尖培養(stem/shoot tip culture),又叫分生組織培養(meristem culture),是包括馬鈴薯在內的許多植物脫除病毒的重要手段。

1943年,P.R White將系統感染了奧古巴花葉病毒的番茄根(長120mm)等分為12段,分別接種到心葉煙上,36h后,接種近生長點的2段在心葉煙上未產生病斑,而接種在遠生長點的10個切段均出現病斑,且離生長點愈遠病斑愈多。B.Kassanis(1957)、Crowley & Hanson(1960)等進一步證明,細胞分裂與病毒復制之間存在著競爭關系,在活躍的莖尖分生組織中,正常核蛋白合成占優勢,病毒粒子得不到復制的營養而受到抑制[13]。

1955年,法國人G.Morel和C.Martin通過莖尖培養,獲得了無PVX、PVA和PVY的馬鈴薯植株,此后,這項技術快速發展,為解決馬鈴薯病毒危害提供了有效途徑。目前,世界上幾乎所有的馬鈴薯生產國都采用這一技術。

我國在20世紀70年代初由吉林農業大學、遼寧省農科院和黑龍江省克山農業科學研究所對莖尖組織培養進行了初步試驗,自1974年開始,中國科學院植物研究所、微生物研究所、動物研究所、黑龍江省克山農業科學研究所、內蒙古烏蘭察布盟農科所以及內蒙古大學等單位協作,開展了莖尖組織無病種薯的技術和應用研究,1976年內蒙古建立了我國第1個馬鈴薯脫毒原種場,從而開始了我國無病毒種薯的生產時代[4]。

莖尖培養脫毒是利用病毒在植物體內分布的不均勻性,即根尖和芽尖的分生組織含病毒量少或不含病毒進行培養。導致這一現象的原因至今還未明確,主要包括:①病毒的復制須利用寄主的代謝過程,無法與分生組織旺盛的代謝活動競爭;②分生組織缺乏真正的維管組織,大多數病毒在植株內通過韌皮部進行遷移,或在細胞間通過胞間連絲傳輸[14]。病毒在細胞與細胞間的移動速度較慢,在快速分裂的組織中病毒濃度高峰被推遲[15-17];③分生組織的生長素濃度通常很高,可能影響病毒的復制。也有一些病毒如PVX,在人們所有觀察的分生組織中都有存在,但通過莖尖培養依然可以脫去PVX,這說明PVX在培養過程中是可以被脫去的,其機制可能是分離組織所產生的某種鈍化因子或培養基中某種成分對病毒的效應所致,也可能是分離組織與培養基接觸的結果。病毒復制時,需要某些作用于靠近分生組織圓錐體細胞的酶類,當莖尖被剝成很小時,它們的生長過程暫時被打亂了,病毒復制時所需要的酶失去作用,從而中斷了傳染性病毒的復制[18]。一般認為,類病毒是無法脫除的,但經過重復莖尖培養結合熱處理也可脫去PSTVd,只是脫毒率太低,具體機制尚待研究[19]。

3馬鈴薯莖尖脫毒技術

馬鈴薯莖尖分生組織培養屬植物組織培養中的體細胞培養[20],莖尖脫毒是多數植物汰除病毒病的方法,其主要技術步驟如下[21,22]:首先將帶毒薯在室內催芽、消毒處理;然后在超凈工作臺無菌條件下,切取0.1~0.3mm、帶1~2個葉原基的莖尖分生組織,移植于裝有MS培養基的試管中培養,大約4個月后,莖尖分生組織長成試管苗;試管苗經過病毒檢測,從大量植株中鑒定出確實不帶病毒的脫毒苗;再經過切段快繁、脫毒微型薯(原原種)的誘導,原種、良種繁育,直至大田生產商品薯[4,23,24]。將莖尖脫毒技術和高效留種技術相結合,并建立科學合理的良種繁育體系,是大幅度提高馬鈴薯產量和質量的可靠保證。

馬鈴薯在脫毒過程中去除了主要病毒,恢復了原品種的特征特性,達到了復壯的目的。同時也將其所感染的真菌和細菌病原物一并脫除,而且脫毒薯在一定時期內,沒有病毒、細菌和真菌病害,其生活力特別旺盛。

4影響馬鈴薯莖尖脫毒效率的因素

4.1莖尖大小和病毒種類

病毒濃度在莖尖附近呈遞減分布,因此莖尖越小脫毒效果越理想,但莖尖就越難成活。此外,不同病毒在莖尖分布不同。一般來說,各種病毒的脫除從易到難順序為:PLRV>PVA>PVY>馬鈴薯奧古巴花葉病毒(PAMV)>PVM>PVX>PXS>PSTVd。但此順序也會因品種、培養條件、病毒株系不同等而有所變化[25-28]。

4.2化學制劑

化學治療劑能提高培養基去除病毒的能力。如在培養基中加入堿性孔雀綠、2,4-D和硫尿嘧啶等病毒抑制劑,能顯著提高無病毒植株的數量。一些研究學者在甘薯莖尖培養脫毒研究中發現,培養基中添加適量的TS制劑(一種病毒鈍化劑)雖稍微抑制了莖尖的發育,但可以提高脫毒率,但TS制劑對馬鈴薯莖尖培養脫毒是否有相同的效果,仍值得研究和探討[29]。

4.3高溫處理

為提高脫毒效果,莖尖培養還可與熱處理結合使用,其方法是脫毒植株長到3cm左右時,進行變溫處理(白天37℃處理12h,晚上25℃處理12h)4周。在一定的溫度范圍內進行熱處理,寄主組織很少受傷害甚至不受傷害,而植物組織中很多病毒卻可被部分地或完全鈍化。如高溫預處理可以顯著提高對PAMV、PVX和PVS的去除[30,31]。

4.4影響病毒去除的其他因素

去除病毒的難易還受其他病毒的干擾:只有PVX存在時,從莖尖培養產生的42株植物中,有34株是無這種病毒的;但當植物受PVX病毒及其他病毒復合侵染時,從莖尖培養產生的34株植物中只有2株是無PVX病毒的,這說明病毒之間存在著干擾作用[27]。此外,病毒去除還與培養條件有密切的關系。通常,接種的莖尖放在培養室內培養,溫度可在15~30℃范圍內,以20℃為宜,光照1 000~3 000Lx,以日光燈為光源,每天照光16h。

5展望

馬鈴薯莖尖培養脫毒是目前脫除病毒最常用、效果最好的方法,在脫毒過程中,影響莖尖成活、成苗及脫毒效率的因素諸多,尤其是莖尖培養過程中培養基中所加的植物生長調節劑的絕對濃度和配比及培養基的狀態等研究上存在著較大分歧。脫毒技術體系中,有關熱處理的方法、莖尖的大小及病毒脫除的難易程度等均有不同的說法和做法。因此,對影響莖尖成活、成苗及脫毒過程中的諸多影響因素進行比較、系統地研究,具有一定的實用價值和現實意義,它可以為馬鈴薯脫毒技術人員提供一條切實可行、高效率的脫毒途徑。

6參考文獻

[1] 屈冬玉,謝開云,金黎平,等.中國馬鈴薯產業現狀與趨勢[C]//中國馬鈴薯學術研討會與第五屆馬鈴薯大會論文集,2004:230-239.

[2] 裴榮信.馬鈴薯小整薯播種的理論與實踐[J].馬鈴薯雜志,1983(3):49-54.

[3] 程天慶.馬鈴薯脫毒高產技術問答[M].北京:科學普及出版社,1994.

[4] 黑龍江省農業科學院馬鈴薯研究所.中國馬鈴薯栽培學[M].北京:中國農業出版社,1994.

[5] 李文剛,寧懷玉.馬鈴薯脫毒微型種薯生產及其繁育推廣體系——鈴田模式[J].中國馬鈴薯,2002,16(2):92-94.

[6] 張志銘.馬鈴薯病害及其防治[M].石家莊:河北科學技術出版社,1992.

[7] 裴榮信.馬鈴薯莖尖脫毒技術的改進[J].石家莊馬鈴薯雜志,1988(2):223-227.

[8] HUBERT Z.Global trend indemand,production and research[C].Procee-dings of the Fifth World Potato Congress,2004:6-8.

[9] ALLAND R H.Principess of Plant Breeding[J].New York,1986(14):25-30.

[10] 郭健,夏同會.組織培養技術在馬鈴薯良種繁育上的應用[J].馬鈴薯雜志,1988(2):100-101.

[11] 屈冬玉,金黎平,謝開云,等.中國馬鈴薯生產現狀、問題和趨勢[C]//馬鈴薯專業委員會2001年年會論文集,2001:1-8.

[12] 中國農業科學院蔬菜研究所.中國蔬菜栽培學[M].北京:農業出版社,1987.

[13] 湯芳德,劉耀宗.馬鈴薯大全[M].北京:海洋出版社,1992.

[14] SALAZAR L F.馬鈴薯病毒及其防治[M].北京:中國農業科技出版社,2001.

[15] HOSAIN M J.Combination of heat treatment and meristem culture for producingvirus-freepotato[J].Bangladesh Journal of Agricultural Resea-rch(Bangladesh),1992,17(2):147-150.

[16] 沈清景,葉貽勛,凌永勝.馬鈴薯脫毒原原種商產快營技術研究[J].福建農業學報,2000,15(4):51-56.

[17] 張希近.脫毒馬鈴薯種苗及原原種生產技術[J].雜糧作物,2000,20(3):22-24.

[18] ERCOLANO MR,CARPUTO D,STRAFACE S,et al.Evaluation of potato genotypes suitable for the pedoclimatic conditions of Campania Solanum tuberosum[J].Plant genetics and breeding(Grop husbandry),1997,31(3):17-28.

[19] 張輔達,孫憲昀.馬鈴薯莖尖培養脫毒研究進展[J].中國馬鈴薯,2004,18(1):35-38.

[20] MOYER J W,SALAZAR L F.Viruses and Viruslike diseases of sweet potato [M].Plant Disease,1989,73(6):451-455.

[21] 裘維蕃.植物病毒學[M].福州:福建科學技術出版社,2001.

[22] 中國科學院遺傳研究所組織培養室三室五組.離體培養馬鈴薯莖頂端(或腋芽)生長點的初步研究[J].遺傳學報,1976,3(1):51-55.

[23] 田波.馬鈴薯無病毒種薯生產的原理和技術[M].北京:科學出版社,1980.

[24] 屈冬玉.2000年馬鈴薯專業年委員會學術年會總結[J].中國馬鈴薯,2000,14(4):249-251.

[25] 馬鈴薯種薯生產協作組.馬鈴薯種薯生產的研究I用莖尖培養法生產馬鈴薯無病毒原種[J].植物學報,1976,18(3):233-238.

[26] 黃楚材,代啟益,李春元.莖尖培養馬鈴薯“雙季1號”獲得無毒植株的研究[J].馬鈴薯雜志,1980(1):4-7.

[27] 林長春,李其文.馬鈴薯莖尖脫毒與種質資源試管保存的研究[J].馬鈴薯雜志,1989,3(2):73-78.

[28] 林長春,滕麗偉.不同形態和種類培養基對馬鈴薯莖尖生育的影響[J].馬鈴薯雜志,1990,4(3):153-154.

[29] 尚佑芬,楊崇良,趙玖華.應用莖尖培養技術防治甘薯病毒病的研究[M].北京:中國農業科技出版,1997.

[30] 劉儀.植物病毒與病毒防治研究[M].北京:中國農業科技出版社,1997.

[31] 陳維倫,陶國清.植物生物技術[M].北京:科學出版社,1987.