番鴨小鵝瘟病毒云浮株的分離與鑒定

周　全　宋永峰　周　麗　黎　敏　高　恒　宋延華　溫納相

【摘要】2008年初, 廣東云浮思勞片區(qū)番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)下痢、張口呼吸、腳軟、堆積、采食量減少等癥狀。發(fā)病后的前3天曾經(jīng)用過(guò)抗生素治療,但沒(méi)有效果,死亡率高達(dá)80%。病理解剖主要表現(xiàn)為腸道中后段膨大約3倍、整個(gè)腸道出血嚴(yán)重 ,有凝固性栓子。肝臟腫大,膽囊明顯膨大,腎臟腫脹。為查明原因,筆者對(duì)發(fā)病的雛鴨進(jìn)行病毒的分離與鑒定工作,通過(guò)病毒分離、PCR、瓊脂擴(kuò)散和動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)獲得1株番鴨小鵝瘟病毒。經(jīng)番鴨胚接種、雛番鴨攻毒試驗(yàn),證實(shí)所分離的病毒具有較強(qiáng)的致病性。

【關(guān)鍵詞】番鴨 小鵝瘟病毒 分離鑒定

小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的1-5周齡雛番鴨和雛鵝的一種急性或亞急性、高度接觸性傳染病[ 1 ]。該病最早由我國(guó)著名學(xué)者方定一于1956年首次發(fā)現(xiàn)[ 2 ],并于1961年在鵝胚中分離到該病毒,目前已呈世界性分布[ 3 ]。臨診癥狀表現(xiàn)為雛番鴨纖維素性腸炎、小腸后段內(nèi)容物形成臘腸樣栓子及肝、腎、心等實(shí)質(zhì)臟器的炎癥,可引起雛番鴨20%-90%的死亡率,是嚴(yán)重危害番鴨養(yǎng)殖的重要病毒病[ 4 ]。本研究對(duì)一份疑似番鴨小鵝瘟病料進(jìn)行了病毒分離鑒定,現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下:

1.材料與方法

1.1 材料

疑似番鴨小鵝瘟病料采自廣東省云浮市某番鴨場(chǎng),健康非免疫番鴨胚和雛番鴨均由思勞孵化廠提供,標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性毒株由本室保存,陽(yáng)性血清由動(dòng)物防疫站惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀與剖檢變化 雛番鴨死前腹瀉嚴(yán)重,糞便呈褐色,瀕死期角弓反張,個(gè)別有神經(jīng)癥狀。經(jīng)剖檢可見(jiàn)整個(gè)腸道充血、出血嚴(yán)重;腸道后段有栓子,肝、膽囊腫大充血、淤血。

1.2.2 病料的處理 無(wú)菌采取疑似感染小鵝瘟瀕死病番鴨的肝臟、腎臟和脾臟,將病料剪碎研磨后,按1∶3比例加入生理鹽水,制成懸液。-70℃/37℃反復(fù)凍融3次,10000r/min離心10min,取上清,過(guò)濾除菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3番鴨胚接種 取上述病毒液以尿囊腔途徑接種12日齡健康非免疫番鴨胚10枚,每枚0.2mL,同時(shí)設(shè)生理鹽水及空白對(duì)照組。37℃培養(yǎng),每日觀察番鴨胚發(fā)育和死亡情況,棄去24h內(nèi)死亡胚,無(wú)菌收集接種后3～7d死亡的番鴨胚和活胚的尿囊液,經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后,低溫保存?zhèn)溆?同時(shí)取出胚體觀察其病理變化。

1.2.4鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 按常規(guī)方法制備鴨胚原代成纖維細(xì)胞(DEF),當(dāng)DEF長(zhǎng)至70%～80%單層時(shí),將GPV病毒液接種于細(xì)胞中,37℃培養(yǎng),觀察細(xì)胞病變。

1.2.5瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 按常規(guī)方法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和分離病毒的番鴨胚尿囊液進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.2.6 PCR檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)合成小鵝瘟檢測(cè)引物,常規(guī)方法提取樣品DNA,進(jìn)行PCR檢測(cè);目的片段約為600bp。

1.2.7病毒致病性測(cè)定 將80只雛番鴨隨機(jī)分成8組。前7組分別注射10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀釋含小鵝瘟病毒的番鴨胚尿囊液,接種量為肌注0.2mL/只,第8組為對(duì)照組。分別隔離飼養(yǎng),連續(xù)觀察,記錄死亡情況。按Reed-Muench法計(jì)算LD50。

1.2.8動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將20只12日齡雛番鴨隨機(jī)分為2組,每組10只,一組為試驗(yàn)組,肌注0.5 mL/只分離的病毒,另一組肌注0.5mL/只生理鹽水作為對(duì)照組,相同條件下隔離飼養(yǎng),觀察15天。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化

2.2番鴨胚接種試驗(yàn) 將待檢病料接種于10只番鴨胚,24h內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)番鴨胚死亡,番鴨胚在24h-96h死亡8枚。胚體觀典型的病變主要為絨毛尿囊膜水腫,有灰白色針尖狀小點(diǎn);胚體充血、出血;喙、趾、頸部皮膚等均有明顯出血點(diǎn);肝臟充血,心肌、后腦出血,頭、頸部及兩肋皮下有水腫,出現(xiàn)小鵝瘟臨床癥狀和剖檢特征。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn) DEF接種病毒后,紡錘形的鴨胚成纖維細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、脫落等明顯的病變,說(shuō)明病毒能在番鴨胚原代細(xì)胞中增殖,結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

2.4瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 分別用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與培養(yǎng)的病毒進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。中央孔為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清,外周為6份培養(yǎng)病毒的番鴨胚尿囊液,每孔加入200uL,酒精燈封底后,置37℃濕盒中,溫育48h后,觀察結(jié)果,可見(jiàn)6份尿囊液均與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清形成明顯的沉淀線,結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.5 PCR檢測(cè) 按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果可見(jiàn)到清晰的目的條帶,即GPV PCR陽(yáng)性,見(jiàn)圖7。

1:陽(yáng)性對(duì)照、2:陰性對(duì)照、3:分離毒株、M:marker2000

2.6病毒致病性測(cè)定

將不同稀釋度的含病毒的番鴨胚尿囊液接種健康非免疫番鴨后,連續(xù)觀察9d,記錄死亡情況,用Reed-Muench法計(jì)算。

從下表可以看出,該毒株的LD50在10-4和10-5之間,按公式計(jì)算(62- 50)/(62- 33)=12/29=0.4,根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法得出分離毒株的LD50= 10-4.6/0.2mL。

2.7動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

接種含毒尿囊液的雛番鴨于接種后第5天開(kāi)始出現(xiàn)癥狀,接毒組出現(xiàn)輕微的腹瀉、不愿走動(dòng)、精神萎頓、食欲減退;后期嚴(yán)重腹瀉,呼吸困難,兩腳麻痹,行走困難,臥地不起,發(fā)病率為100%。

剖檢可見(jiàn)小腸粘膜充血或出血,肝臟稍腫大,呈深紫色,表面有出血點(diǎn);膽囊明顯膨大,充滿暗綠色膽汁;腸粘膜彌散性出血,腸道尤其是靠近回盲部的腸段呈現(xiàn)典型的卡他性、纖維素性、壞死性腸炎的變化,質(zhì)地堅(jiān)實(shí),似香腸樣,壞死的腸粘膜、滲出的纖維素等凝固形成的栓子。陰性對(duì)照組的10只雛番鴨正常。

3. 小結(jié)和討論

3.1 盡管小鵝瘟病毒的血清型只有一種,其自然感染宿主也只有雛番鴨和雛鵝, 但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)分離毒株毒力不同[ 8,9 ], 使該病難于預(yù)防和治療, 這也是常規(guī)疫苗的免疫保護(hù)失敗的主要原因[ 11 ]。

3.2 本試驗(yàn)分離的小鵝瘟地方株能使番鴨胚產(chǎn)生特征性病變;在動(dòng)物回歸試驗(yàn)中, 可使雛番鴨出現(xiàn)典型小鵝瘟癥狀;本病毒能被小鵝瘟陽(yáng)性血清中和;分離毒株這些特性與鵝細(xì)小病毒一致, 確認(rèn)所分離病毒株為鵝細(xì)小病毒[ 12 ], 該病毒是雛番鴨和雛鵝疫病的主要病原之一, 對(duì)番鴨養(yǎng)殖業(yè)危害極大[ 13 ]。

參考文獻(xiàn):

[ 1 ]蔡寶祥. 家畜傳染病學(xué)(第四版) [M] . 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001 ,334 - 336.

[ 2 ]方定一. 小鵝瘟的介紹[J] . 中國(guó)畜牧獸醫(yī)醫(yī)學(xué)雜志,1998 ,5 (7) :19 - 20.

[ 3 ]殷震, 劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M].2 版.北京: 科學(xué)出版社, 1997: 1165- 1168.

[ 4 ] 胡桂學(xué),高光,鄒嘯環(huán). 小鵝瘟病毒分離與初步鑒定[J] . 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2002 ,6 (2) :41 - 43.

[ 5 ] 唐桂遠(yuǎn),武華澤. 禽病原分離鑒定手冊(cè)[M] . 北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993 :208 - 229.

[ 6 ] 劉登明,廖德惠,謝竟懷. 小鵝瘟病毒提純的研究[J] . 中國(guó)畜禽傳染病,1989 , (6) :47 - 48.

[ 7 ] 李桂霞, 劉勝旺, 孔憲剛 等.鵝細(xì)小病毒HG5/82 株的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2005, 27(3): 196- 201.

[ 8 ] 周瑞進(jìn), 布日額, 韓先杰 等.鵝細(xì)小病毒免疫血清的制備及其應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科技, 2004, 12( 34) : 63- 66.

[ 9 ] 布日額, 王君偉, 吳金花等.GPV 野毒株鑒定及其致病力試驗(yàn)[J].中國(guó)家禽, 2003, 16( 25) : 8- 10.

[ 10 ] 趙愛(ài)玲. 小鵝瘟的診斷及病毒分離鑒定[J] . 畜牧獸醫(yī)科技信息,2005 ,11 :91.

[ 11 ] 陳曉月,趙承輝,劉爽. 小鵝瘟地方株的分離鑒定及致病力試驗(yàn)[J] . 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007 ,38 (3) :410 - 412.

[ 12 ] 吳繼秋,李東華,金紅范等. 小鵝瘟病毒的分離與初步鑒定[J] . 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),2005 ,3 (1) :26 - 30.

[ 13 ] 李云龍,于 剛,姜鳳華等. 小鵝瘟病原分離及鑒定[J] . 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2008 ,3 :39 - 40.

作者簡(jiǎn)介:周全(1982-),男,湖北黃岡人,本科,現(xiàn)于廣東溫氏食品集團(tuán)研究院工作,主要從事禽病相關(guān)研究工作。