一株降解甲氰菊酯的光合細菌的分離鑒定及其降解酶初步分析

羅源華　張戰泓　劉　勇　張松柏　張德詠　羅香文　成飛雪

摘要:從某農藥廠污泥中篩選分離出一株高效降解甲氰菊酯(Fenpropathrin)的光合細菌,研究了其降解特性及生物學特性。根據分離菌株的細胞形態結構、活細胞光吸收特征、生理生化特征及其16S rDNA序列同源性鑒定降解菌;氣相色譜法測定該菌降解甲氰菊酯的能力;采用超聲波破碎法提取該菌降解粗酶,利用(NH4)2SO4分段鹽析并測定酶活性。結果表明:PSB07-14屬紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas sp.);該菌以共代謝方式降解甲氰菊酯,對甲氰菊酯的最高耐受濃度為800 mg/L,降解最佳條件為:30～35 ℃、pH6～7,光照培養15 d對600 mg/L甲氰菊酯降解率達48.41%。降解酶測定結果表明:30%～60%(NH4)2SO4沉淀的蛋白降解活性最高。

關鍵詞:甲氰菊酯;紅假單胞菌;生物降解;降解酶

中圖分類號:X172文獻標識碼:A文章編號:1006-6500(2009)02-0001-05

Isolation, Identification of Fenpropathrin-degrading Strain PSB07-14 and Preliminary Analysis of Its Degradation Crude Enzyme

LUO Yuan-hua1,ZHANG Zhan-hong3,LIU Yong1,2,ZHANG Song-bai1,2,ZHANG De-yong1,2,LUO Xiang-wen1, CHENG Fei-xue1

(1.Hunan Plant Protection Institute,Changsha,Hunan 410125,China;2. Branch of Longping,Graduate College,Central South University,Changsha,Hunan 410125,China;3. Hunan Vegetable Institute,Changsha,Hunan 410125,China)

Abstract:A photosynthetic bacterial strain PSB07-14, with degradability of fenpropathrin, was isolated and identified as Rhodopseudomonas sp. based on its morphology, physiology and homology of 16S rDNA sequence. The degrading characteristics showed the optimum conditions of degrading fenpropathrin were 30～35 ℃, pH 6～7, respectively. This strain could grow in the media supplied with fenpropathrin up to 800 mg/Land degrade fenpropathrin by co-metabolic way. The degradation rate of fenpropathrin was up to 48.41% in a concentration of 600 mg/L within 15 d. The degradation crude enzyme was extracted and subsided by (NH4)2SO4, the results of subsiding enzyme activity showed the highest enzyme activity appeared in the subsiding of 30%～60%(NH4)2SO4.

Key words: fenpropathrin;Rhodopseudomonas sp. PSB07-14;biodegradation;degradation enzyme

甲氰菊酯,化學名稱2-氰基-3-苯氧基芐基-2,2,3,3-四甲基環丙烷酸酯,商品名滅掃利,對鱗翅目、同翅目、半翅目、雙翅目、鞘翅目等多種害蟲有效,同時對多種害螨的成螨、若螨和螨卵有一定的防治效果[1],適用于棉花、蔬菜、果樹、玉米、大豆、煙草、茶葉等作物以及林木、家畜、衛生和倉儲等害蟲防治,對一些農作物還有促進生長、增加產量、改善品質的作用。

雖然甲氰菊酯對高等動物毒性中等,在試驗劑量內對試驗動物未發現致畸、致突變和致癌作用。但是,對魚類等水生生物、蜜蜂、家蠶等高毒,對光、熱、潮濕穩定,在環境中的半衰期較長,長期使用,環境中大量殘留,會帶來嚴重的環境污染和生態風險。這迫使我們尋找一種切實有效的方法來解決這一難題 [2,3]。以生物修復(Bioremediation)為理論基礎的農藥殘留降解菌技術為降低農產品和農業生產環境中的農藥殘留物提供了希望,該技術具有高效、無毒、無二次污染的特點,而且經濟實用,操作簡便,目前已成為去除農藥殘留污染的一種重要方法。國內外有很多關于農藥殘留降解菌研究的報道,由于菊酯類農藥在20世紀80年代才在我國廣泛使用,對該類農藥的研究起步較晚,對擬除蟲菊酯類農藥的降解菌報道相對較少[3,4]。因此,篩選更多類型的甲氰菊酯高效降解菌,對甲氰菊酯殘留的生物修復研究和應用具有十分重要的意義。

筆者從某農藥廠污泥中分離到一株能降解甲氰菊酯的光合細菌PSB07-14,對其降解甲氰菊酯的特性進行了研究。該研究為利用光合細菌降解甲氰菊酯殘留及其降解機理、克隆降解酶基因打下了基礎。

1材料和方法

1.1培養基、試劑和主要儀器

光合細菌(PSB)培養基:MS培養基添加0.15%酵母膏,參照文獻[5];選擇培養基:在PSB培養基中加入一定濃度的甲氰菊酯;固體培養基:在培養基中加入1.5%的瓊脂。

主要試劑:40 %甲氰菊酯乳油,海南正業化工有限公司惠贈;98 %甲氰菊酯標準品購自天津東方綠色技術發展有限公司;其它農藥殘留檢測試劑均為色譜純。

主要儀器:農藥殘留檢測在湖南省植物保護研究所農藥殘留檢測室進行。6890N氣相色譜儀 (Agilent, USA)、掃描電子顯微鏡(JEXL-230,日本電子公司)、分光光度計(Tu-1901,北京普析通用儀器有限責任公司)、光照培養箱(GZP-350,上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2培養條件

光合細菌培養采用130 mL的血清瓶。培養條件(除特別說明外):厭氧光照培養,(30±2)℃,2 000 lx光照培養6～7 d;黑暗好氧培養,黑暗條件下,(30±2)℃,培養6～7 d。每天搖瓶混勻1次。

1.3降解菌的分離、篩選

將采自某農藥廠的污泥2.0 g加入120 mL PSB培養基中,光照培養7 d后,取1%菌液接種到含甲氰菊酯100 mg/L的選擇性液體培養基中,光照培養7 d,取300 μL菌液稀釋涂布到選擇性固體培養基中,挑取菌落形態不同的菌,分別接種到含甲氰菊酯100 mg/L選擇性液體培養基中,光照培養7 d,取1%分別接種到含甲氰菊酯200,400,600,800,1 000 mg/L選擇培養基中,15 d后檢測培養基農藥濃度,以含相同濃度的甲氰菊酯,相同培養條件不接種細菌的培養基為對照。選擇降解率最大的細菌進行后續研究,命名為PSB07-14,后續試驗中1 mL菌液中約含活細胞109個。

1.4菌種的鑒定

1.4.1電鏡樣品制備及觀察將活的細菌滴到具膜載網上,然后進行磷鎢酸染色,TEM(transmission- scanning electron microscope)觀察拍照。

1.4.2吸收光譜的測定取1.5 mL培養5 d的光合細菌培養液,8 000 r/min離心洗滌3次,用0.9 %生理鹽水重懸浮,在分光光度計上于200～900 nm掃描。

1.4.3菌株的生理生化特征的測定見參考文獻[6]。

1.4.4菌體16S rDNA序列的測定及同源性分析細菌基因組提取采用UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)。以所提的細菌總DNA為模板,采用細菌16S rDNA通用引物擴增[5],PCR反應體系(50 μL):10×PCR Buffer 2.5 μL;MgCl2(25 mmol/L) 2 μL;dNTP(10 mmol/L) 2 μL;引物Bpf/Bpr(25 μmol/L) 各0.5 μL;Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL;雙蒸水 43 μL。PCR反應條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循環30次;72 ℃ 10 min。反應完成后,經1%瓊脂糖電泳,檢測擴增片斷的大小和特異性。PCR產物純化后,委托上海生工生物工程公司測序。將PSB07-14測得的16S rDNA序列在Genbank中利用blast進行比對,比較不同細菌間的相似性。

1.5甲氰菊酯含量的測定

整瓶培養液,用正己烷萃取3次,每次用量分別為40,40,30 mL。氮吹儀上吹干,然后用正己烷溶解并定容至10 mL,接著加入無水硫酸鈉脫水。氣相色譜測定其含量[4]。以98 %甲氰菊酯標樣定性定量,所有數據為3次重復平均值。

測試條件:氣相色譜儀型號Agilent 6890N,色譜柱型號為HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm),采用程序升溫法:毛細管柱起始溫度160 ℃,保持5 min,10 ℃/min升至200 ℃,保持1 min,10 ℃/min升至280 ℃,保持8 min,檢測器(μECD)溫度320 ℃,進樣口溫度250 ℃,載氣為N2(純度99.999 9 %),流量1 mL/min。進樣量均為1 μL。

降解率的計算方法:降解率=(1-C1/C0)×100%

其中,C1為降解菌處理甲氰菊酯殘留濃度(mg/L),C0為對照處理甲氰菊酯殘留濃度(mg/L)。

1.6 降解酶的提取與鹽析

15 mL離心管加入10 mL培養7 d的PSB07-14菌液,8 000 r/min離心2 min,倒去上清液,重復1次,收集菌細胞,倒去上清液,加入等體積的PBS(pH7.2)緩沖液,降解粗酶的提取采用超聲波破碎儀破碎菌體細胞[7],12 000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液,考馬氏亮藍法測定蛋白的濃度[8],用PBS緩沖液調整蛋白濃度為10 mg/L做后續實驗。取50 mL粗酶液,加入(NH4)2SO4鹽析,靜置10 min,離心收集沉淀,PSB(pH7.2)緩沖液溶解,并調整蛋白濃度為1 mg/mL[8]。酶活力測定參照文獻[7],本試驗的1個酶活力單位(U)定義為在本試驗條件下1 min內甲氰菊酯減少的微摩爾數。

2結果與分析

2.1菌株鑒定

2.1.1培養特征和活細胞光吸收特征培養結果表明,PSB07-14最佳生長溫度為30～35 ℃、pH6.5～7.5,具有紅色培養物、黑暗好氧生長慢以及耐鹽低于3%的Rhodopseudomonas的特征[6]。活細胞光吸收結果表明(圖1),該菌含有細菌葉綠素a及類胡蘿卜素[5],表明該菌屬于紫色非硫細菌。

2.1.2形態結構和生理生化特征圖2的電鏡結果表明,PSB07-14為桿狀,大小為0.6～1.0 μm×2.4～3.1 μm,端生鞭毛,以二分裂方式繁殖。生理生化分析結果表明(表1):G-,V-P反應陰性,甲基紅反應陰性,不能利用淀粉,H2S反應陰性;可以利用多種小分子的有機酸生長,也能利用部分氨基酸和醇類化合物進行生長。PSB07-14的形態結構和生理生化特征與Rhodopseudomonas基本一致[6]。

2.1.316S rDNA序列分析PSB07-14測定的16S rDNA序列長度為1 429 bp (Genbank accession No.FJ798824),Blast結果表明,在Genebank中,與Rhodopseudomonas palustris strain HZ-1 (EU703955)和Rhodopseudomonas sp. TUT3625 (AB250616) 的同源性分別為98%和97%。

2.1.4鑒定結果根據Bergeys Manual of Determinative Bacteriology[6],將PSB07-14鑒定為Rhodopseudomonas sp.。

2.2菌株對甲氰菊酯的降解

2.2.1對甲氰菊酯的耐受濃度在120 mL PSB液體培養基中,加入5 mL菌液和適量甲氰菊酯,使培養基中甲氰菊酯終濃度為200,400,600,800,1 000 mg/L,光照培養,第15 天觀察PSB07-14的生長情況。結果如表2示,PSB07-14耐受甲氰菊酯的最大濃度為800 mg/L。

2.2.2對甲氰菊酯的降解120 mL的PSB液體培養基中加入5 mL PSB07-14和適量甲氰菊酯,使其最終濃度為600 mg/L,光照培養15 d取樣測定甲氰菊酯的殘留量,以含600 mg/L甲氰菊酯培養液為對照。甲氰菊酯在光照下,經過15 d有一定量的降解,可見光照對甲氰菊酯有一定的降解效果,但作用并不是很大(4.13%)。PSB07-14在600 mg/L甲氰菊酯培養液中培養15 d,對甲氰菊酯的降解率為48.41%(表3)。

2.2.3最佳降解條件在pH為5,6,7,8,9,10的120 mL的PSB培養基中,加入5 mL的PSB07-14菌液和適量甲氰菊酯,其最終濃度600 mg/L,光照培養15 d后取樣,樣品經萃取后檢測甲氰菊酯殘留量。結果表明(圖3),pH在6～8之間,PSB07-14的降解效能都比較好,最適pH為7。

在120 mL含甲氰菊酯600 mg/L的PSB培養基中,加入5 mL的PSB07-14菌液,不同溫度下,光照培養15 d后測定甲氰菊酯殘留量。圖4表明,PSB07-14在25～35 ℃之間,具有良好的甲氰菊酯降解能力,在35 ℃降解能力最好。溫度過高或過低都顯著影響菌株的降解能力,當溫度低于25 ℃或高于45 ℃,菌株幾乎喪失降解能力。

2.2.4菌株對甲氰菊酯的共代謝特點PSB07-14在以甲氰菊酯為唯一碳源的PSB培養基中不生長(表4),但在有其他碳源(酵母膏)存在時可以降解甲氰菊酯,表明PSB07-14是以共代謝的方式降解甲氰菊酯[9]。

2.3分段鹽析粗蛋白降解活性

分段鹽析粗蛋白降解活性表明,30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性為38.27 U/L,大大高出0～30%、60%～80%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白的活性(表5)。

3討 論

通過富集培養法分離出甲氰菊酯降解菌PSB07-14,生理生化方法和16S rDNA序列同源性將其鑒定為Rhodopseudomonas sp.。在農藥殘留的降解菌研究中,光合細菌的研究報道相對較少;光合細菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)是地球上最早出現的具有原始光能合成體系的原核生物。近年來,對光合細菌的應用研究獲得了很大的進展。研究表明,光合細菌在種植、養殖、新能源開發利用以及醫藥方面具有十分廣闊的前景[10-13]。在環境治理方面,光合細菌可以有效地處理有機廢水[14],凈化水質[15],降解芳香族化合物[13]。在農藥降解方面,光合細菌可以有效地降解有機磷農藥[5]、 硫代磷酸酯類農藥[16]。而且光合細菌具有很好的促進作物生長和提高作物抗逆性的作用[17],因此,篩選光合細菌降解菌具有良好的應用前景。

PSB07-14對高濃度的甲氰菊酯具有良好的降解效果,在600 mg/L甲氰菊酯培養液中培養15 d,對甲氰菊酯的降解率為48.41%。高于丁海濤等[18]分離的降解菌降解速率以及筆者先前分離的光合細菌株PSB07-19[19],與洪源范等[9]分離的降解菌降解速率相當。PSB07-14降解甲氰菊酯的最佳條件與該菌生長的最佳條件基本一致,表明該菌具有潛在的實際應用價值。

PSB07-14不能以甲氰菊酯作為唯一碳源,只能以共代謝的方式降解甲氰菊酯。表明PSB07-14對甲氰菊酯的降解作用是一種酶促反應,該結果與洪源范等[9]的研究結果一致。

PSB07-14降解酶分段鹽析結果表明,在30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性為38.27 U/L,該研究為降解酶的分離純化提供了參考。其降解酶的研究以及降解酶基因的克隆是下一步的工作方向。

參考文獻:

[1] 中國百科網. 甲氰菊酯[EB/OL]. http://www.chinabaike.com/article/396/397/2007/2007031293322.html,2009-03-05.

[2] George N, Kalyanasundaram M. Chemistry of synthetic pyrethroid insecticides-some recent advances[J]. Journal of Scientific and Industrial Research, 1994, 53: 933-945.

[3] 王兆守,李順鵬.擬除蟲菊酯類農藥微生物降解研究進展[J].土壤,2005,37(6):577-580.

[4] Tallur P N, Megadi V B, Ninneker H Z. Biodegradation of cypermethrin by Micrococcus sp. strain CPN 1[J]. Biodegradation, 2008, 19: 77-82.

[5] 張德詠,譚新球,羅香文,等.一株能降解有機磷農藥甲胺磷的光合細菌HP-1的分離及生物學特性的研究[J].生命科學研究,2005,9(3):247-253.

[6] Hot G J, Krieg R N, Sneath H A P, et al. Bergeys manual of determinative bacteriology[M]. Baltirnore: Willianms & Wilkins, 1994.

[7] 林淦,姚威.陰溝腸桿菌W-1粗酶液對氯氟氰菊酯的降解效果及其作用機理[J].江蘇農業科學,2006(3):191-192,198.

[8] Marshak D R, Kadonaga J T, Burgess R R, et al. 蛋白質純化與鑒定實驗指南[M].朱厚礎,譯.北京:科學出版社,2000.

[9] 洪源范,洪青,武俊,等.甲氰菊酯降解菌JQL4-5的分離鑒定及降解特性研究[J].環境科學,2006,27(10):2100-2104.

[10] 夏宏,夏青.光合細菌在早熟甘藍、油菜上的應用研究[J].山西農業大學學報,2000,39(2):116-118.

[11] 張信娣,金葉飛,陳瑛.光合細菌對魚病原細菌生長的影響[J].中國生態農業學報,2008,16(3):659-663.

[12] 張全國,荊艷艷,李鵬鵬,等.包埋法固定光合細菌技術對光合產氫能力的影響[J].農業工程學報,2008,24(4): 190-193.

[13] 史國富.光合細菌在醫藥保健品方面的應用進展[J].科技情報開發與經濟,2003,13(7):99-100.

[14] 呂紅,周集體,王競.光合細菌降解有機污染物的研究進展[J].工業水處理,2003,23(10):9-12.

[15] 鄧曉皋,唐赟.幾株光合細菌的分離鑒定及用于水質凈化的初步研究[J].四川師范學院學報:自然科學版,2001,22(1): 84-88.

[16] 李樂,李蘭生,孫濤,等.固定化光合細菌降解氧化樂果[J].農業環境科學學報,2006,25: 721-725.

[17] 揭晶,趙越.光合細菌應用的研究進展[J].廣東藥學院學報,2006,22(1): 113-115.

[18] 丁海濤,李順鵬,沈標,等.擬除蟲菊酯類農藥殘留降解菌的篩選及其生理特性研究[J].土壤學報,2003, 4(1): 123-129.

[19] 張松柏,張德詠,羅香文,等. 甲氰菊酯降解菌的鑒定及其降解特性[J]. 環境污染與防治,2008,30(7):9-11.