草坪草褐斑病菌次生代謝物的生物活性測定

孫淑琴　劉水芳　楊秀榮

摘要:以病原菌的致病因子為出發點,對病原菌次生代謝物的生物活性進行了測定。研究結果表明,立枯絲核菌的代謝產物能引起與病原相似的病斑,并且毒害作用大小與其致病力存在一定相關性。代謝產物對胚根伸長、胚芽生長均造成一定影響,抑制作用可分別達到42.06%~91.20%、2.31%~18.79%,但對種子發芽率無太大影響。

關鍵詞:草坪褐斑病;次生代謝物;生物活性

中圖分類號:S432.1文獻標識碼:A文章編號:1006-6500(2009)02-0075-03

Bioactivity Assay of Secondary Metabolites of Rhizoctonia solani

SUN Shu-qin,LIU Shui-fang,YANG Xiu-rong

(Tianjin Institute of Plant Protection,Tianjin300112,China)

Abstract:In this paper, the bioactivity of secondary metabolites that was the pathogenic factor of brown patch disease probably was assayed. The results showed that disease spots that caused by metabolites was similar to that of pathogen and the pathogenicity and the toxicity effect had some correlations. Secondary metabolites had not great influence on the germination rate but had some influence on the growth of radicle and embryo, the inhibition effect was 42.06%~91.20% and 2.31%~18.79%, respectively.

Key words: brown patch disease;secondary metabolites;bioactivity

草坪褐斑病(Brown Patch Disease)又稱夏枯病或立枯絲核疫病,是報道最早、分布最廣的草坪草病害之一。受害草坪在發病條件適合時,短時間內可發展成2 m左右的枯草斑,極大地影響草坪的觀賞價值和使用價值,造成巨大的經濟損失。

草坪褐斑病病原主要是絲核菌屬的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)。研究表明,立枯絲核菌菌株的代謝產物與其對寄主的致病能力存在顯著正相關,說明代謝產物在病原菌的致病過程中起重要作用。本研究對草坪草褐斑病病原菌的代謝產物進行了生物活性測定,以明確代謝物在致病過程中的作用,并為病害的防治提供可靠的理論基礎和科學依據。

1材料和方法

1.1立枯絲核菌致病性測定

采用噴霧接種法,把采自天津市的20份褐斑病病原立枯絲核菌接種到修剪后的盆栽高羊茅葉片上。接種后覆膜保濕24 h,一周后調查病害發生情況,篩選強、弱致病力菌株。

1.2立枯絲核菌代謝產物的生物活性測定

1.2.1代謝產物的制備將菌株R.H2、R.S1在PDA上擴大培養后,用直徑0.5 cm打孔器在菌落邊緣打孔,挑5塊菌絲塊接種于150 mL PS培養液中,25 ℃靜置培養15 d。培養液2層濾紙過濾后備用。

1.2.2代謝產物對離體葉片的致病性在培養皿中先鋪2層濾紙,加入10 mL無菌水,再在濾紙上置2個載玻片,將高羊茅葉片置載玻片上。用微量注射器針刺高羊茅葉片造成傷口,在傷口處分別放直徑0.5 cm的菌盤和20 μL代謝液,以蒸餾水為對照,置室溫培養。3 d后觀察傷口處癥狀。

1.2.3代謝產物對高羊茅胚根、胚芽生長的抑制作用用55～60 ℃溫水浸泡高羊茅種子,表面消毒2 h,再用絲核菌代謝產物浸泡6 h,紗布包好后置培養箱中催芽3 d。挑取一致的種芽測量胚根、胚芽長度后,放入鋪有2層濾紙含10 mL代謝液的培養皿中,每皿20粒,以含10 mL水的培養皿為對照,每處理3次重復。25 ℃培養3 d后測量胚根、胚芽長度,計算凈增量和抑制率。

1.2.4代謝產物對高羊茅種子發芽率的影響將病原菌代謝液10 mL注入鋪有2層濾紙的培養皿中,每皿放入100粒高羊茅種子,設含10 mL水的培養皿為對照,每處理3次重復。3 d后檢測種子的發芽率。

2結果與分析

2.1立枯絲核菌致病性測定

葉片發病后按以下標準調查葉片病情指數。0級:無病斑;1級:病斑面積占葉面積的10%以下;2級:病斑面積占葉面積的10%～25%;3級:病斑面積占葉面積的26%～50%;4級:病斑面積占葉面積的51%～70%;5級:病斑面積占葉面積的71%以上。

調查結果表明,接種的20份褐斑病病原均可引起高羊茅發病,但發病程度不同,病情指數在18%～76%。選取高病情指數即強致病力菌株R.H2和低病情指數即弱致病力菌株R.S1作為目標菌。

2.2立枯絲核菌代謝產物的生物活性測定

2.2.1代謝產物對離體葉片的致病性針刺葉片分別接種絲核菌R.H2和R.S1的菌盤、代謝液,結果表明,立枯絲核菌代謝產物可在一定程度上引起高羊茅葉片產生褐斑病病斑,但發病程度不同:R.H2菌盤>R.H2代謝液>R.S1菌盤>R.S1代謝液。病斑褪綠,呈圓形、橢圓形至不規則形,顏色為褐色。對照處理在針刺點處只有極小的枯死圈,而無病斑和褪綠斑。據此可以推測絲核菌代謝產物中含有對葉片有一定的毒害作用的物質,病原菌浸染草坪草后,病斑的形成可能與其有關。并且代謝物的毒害作用大小與病原菌的致病力強弱有一定的相關性。

2.2.2代謝產物對高羊茅胚根、胚芽生長的抑制作用研究結果表明(表1、表2),強致病力菌株R.H2處理的胚根根尖生長點變褐,伸長受到很大的抑制,3 d內由處理前的23 mm增長為處理后的23.9 mm,生長抑制率達91.20%,而胚芽伸長受到的影響較小,抑制率為18.79%。弱致病力菌株R.S1處理后,根尖顏色無變化,生長受到較小抑制,由處理前的17.4 mm增長為處理后的23.3 mm,生長抑制率為42.06%,胚芽生長抑制率僅為2.31%。經SSR方差分析結果顯示,菌株R.H2與R.S1代謝產物對胚根、胚芽的毒害作用大小均存在顯著差異。

2.2.3代謝產物對高羊茅種子發芽率的影響不同處理的種子發芽率測試表明,各處理對種子發芽率無太大影響且各處理間差距不大,說明絲核菌代謝產物對種子發芽率無明顯影響。

3討 論

本試驗初步研究了草坪草褐斑病病原立枯絲核菌的次生代謝物的生物活性,結果表明,代謝物能引起與病原相似的病斑,并對高羊茅種子胚根、胚芽的伸長造成影響,而對種子的發芽率無影響,并且強致病力菌株R.H2與弱致病力菌株R.S1的代謝產物對離體葉片的致病作用、對胚根和胚芽的毒害作用均有明顯的差異,表明草坪草褐斑病的代謝產物的毒害作用大小可能與其致病性存在相關性。這些結果均與有關報道一致。

近幾十年的研究成果表明,植物病原物產生的對寄主植物有害的代謝產物主要有酶、毒素和激素等。很多研究認為,病菌代謝產物的多少及其活力大小影響其致病力強弱。國內外對草坪草褐斑病已做了大量研究,但有關病原菌代謝產物的報道很少,多見于同屬的病原菌。Sriram等提出水稻紋枯病病原立枯絲核菌的致病性與產生的毒素有關。徐艷等研究表明水稻紋枯病病原立枯絲核菌能產生毒素,并且毒素在病菌致病過程中起重要作用。張華東等研究表明水稻紋枯病病原立枯絲核菌菌株的產毒能力與其對水稻植株的致病能力存在顯著正相關,相關系數為0.825 5。徐敬友等在研究水稻紋枯病菌時認為,病原菌的致病因子有毒素和細胞壁降解酶2種因子,其中哪個因子更重要一些,有待進一步研究。Bateman等則認為果膠酶是立枯絲核菌的致病因子。

本研究的結果表明,草坪草褐斑病病原立枯絲核菌的代謝產物在在致病過程中發揮重要作用,至于代謝產物中發揮作用的物質是毒素還是細胞壁降解酶或果膠酶或是兩者共同作用,正在進一步研究中。

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