XAF1基因誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株BxPC3凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

黃佳 諸琦 曹海霞 姚瑋艷 章永平 袁耀宗

·論著·

XAF1基因誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株BxPC3凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

黃佳 諸琦 曹海霞 姚瑋艷 章永平 袁耀宗

目的探討Ad5/F35腺病毒介導(dǎo)的XAF1基因誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞BxPC3凋亡及其可能的作用機(jī)制。方法將前期構(gòu)建的重組腺病毒Ad5/F35-XAF1感染胰腺癌細(xì)胞BxPC3。采用半定量RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)法檢測(cè)感染前后BxPC3細(xì)胞XAF1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化；運(yùn)用Annexin-V/PI和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率；免疫蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞Caspase-3、PARP、Caspase-8和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果Ad5/F35-XAF1感染后，BxPC3細(xì)胞的XAF1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，與空白組和Ad5/F35-Null對(duì)照組比較，差異顯著(Plt;0.05)；兩種方法檢測(cè)的細(xì)胞凋亡率分別為(19.90±3.09)%、(9.29±2.13)%，較Ad5/F35-Null組的(6.72±0.76)%、(2.73±0.51)%和空白組的(7.22±1.53)%、(1.56±0.47)%均有顯著差異(Plt;0.01)；Caspase-3、PARP、Caspase-8蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)降低。結(jié)論Ad5F35-XAF1重組腺病毒感染胰腺癌細(xì)胞BxPC-3能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是激活死亡受體途徑和線粒體途徑。

胰腺腫瘤； 腺病毒； XAF1基因; 細(xì)胞凋亡

X染色體連接的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP)是凋亡核心介導(dǎo)因子——凋亡抑制蛋白家族中作用最強(qiáng)的成員[1]，而XIAP相關(guān)因子1(XIAP-Associated Factor 1,XAF1)是XIAP負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一。它在所有胚胎組織及成人正常組織中廣泛表達(dá)，但在許多腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株中低表達(dá)甚至不表達(dá)[2]，提示XAF1是一種潛在的腫瘤抑制因子。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用前期構(gòu)建的重組腺病毒Ad5/F35-XAF1[3]，觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞BxPC3凋亡的影響。

材料和方法

一、重組腺病毒感染人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3

重組腺病毒Ad5/F35-XAF1及陰性對(duì)照腺病毒Ad5/F35-Null由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。常規(guī)培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，將Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-Null用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋后感染細(xì)胞。2 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

二、XAF1mRNA檢測(cè)

采用Trizol(Invitrogen公司)法提取細(xì)胞總RNA。運(yùn)用MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物公司)合成cDNA。XAF1引物序列：上游5′-TCCGGAATTCATGCTCCACGAGTCCTACTG-3′,下游5′-ACGCGTCGACAAACTCTGAGTCTGGACAAC-3′,產(chǎn)物大小260 bp；β-actin引物序列：上游5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3′,下游5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′,產(chǎn)物大小830 bp。PCR反應(yīng)后產(chǎn)物行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)攝影。

三、XAF1、Caspase-3、PARP 、Caspase-8和Bcl-2蛋白檢測(cè)

用細(xì)胞裂解液(申能博彩公司)抽提細(xì)胞總蛋白。取20 μg蛋白常規(guī)行免疫蛋白印跡。抗β-actin一抗1∶5000稀釋?zhuān)筙AF1一抗、抗Caspase-3、抗PARP、抗Caspase-8和抗Bcl-2一抗均1∶1000稀釋。最后ECL顯影。

四、細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

取Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-Null感染細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為105～106個(gè)/ml。取細(xì)胞懸液490 μl，應(yīng)用Annexin-V/PI法及TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，均重復(fù)3次。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。多組間均數(shù)比較采用單向方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BxPC3細(xì)胞的XAF1 mRNA 和蛋白的表達(dá)

Ad5/F35-XAF1感染BxPC3細(xì)胞48 h后，XAF1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增高，而空白組和Ad5/F35-Null組細(xì)胞的XAF1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平很低或不表達(dá)(圖1)，差異具有顯著性(Plt;0.05)。

二、BxPC3細(xì)胞凋亡率的變化

采用Annexin-V/PI法，Ad5/F35-XAF1感染BxPC3細(xì)胞48 h后，早期凋亡率為(19.90±3.09)%，與Ad5/F35-Null組(6.72±0.76)%和空白組(7.22±1.53)%相比，差異顯著(圖2，Plt;0.01)；采用TUNEL法，感染BxPC3細(xì)胞48 h后細(xì)胞的凋亡率為(9.29±2.13)%，而Ad5/F35-Null組和空白組分別為(2.73±0.51)%和(1.56±0.47)%，差異均具有顯著性(圖3，Plt;0.01)。

圖1 感染前(下)、后(上)BxPC3細(xì)胞XAF1的表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BxPC3細(xì)胞凋亡率

三、BxPC3細(xì)胞Caspase-3、PARP、Caspase-8和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

Ad5/F35-XAF1感染后，BxPC3細(xì)胞Caspase-3、PARP和Caspase-8蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)明顯降低，較Ad5/F35-Null組和空白組均有顯著性差異(圖4)。

圖3TUNEL法檢測(cè)Ad5/F35-XAF1感染48 h后BxPC3細(xì)胞的凋亡

圖4 各組BxPC3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

討 論

XAF1是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，能通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[4]，并且可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物致凋亡作用的敏感性[5]。小鼠內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度表達(dá)XAF1，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并且抑制血管的生成[6]。史冬梅等[7]報(bào)道XAF1能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡，并增加肝癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶和羥基喜樹(shù)堿的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組腺病毒Ad5/F35-XAF1感染胰腺癌細(xì)胞BxPC3 48 h后，XAF1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增高，凋亡率顯著增加，說(shuō)明胰腺癌細(xì)胞過(guò)度表達(dá)XAF1能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

Liston等[8]研究發(fā)現(xiàn)，XAF1與XIAP結(jié)合后使其重定位于細(xì)胞核，它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗XIAP對(duì)caspase-3的抑制作用以激活Caspase-3，-7，-9的活性。本結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞株BxPC3過(guò)度表達(dá)XAF1后，caspase-3、PARP和caspase-8的活化都明顯增強(qiáng)。新近的研究表明，除了拮抗XIAP的作用之外，XAF1還能激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而增強(qiáng)TNFα誘導(dǎo)的由死亡受體介導(dǎo)的凋亡作用[9-10]。胰腺Bcl-2是一種原癌基因，過(guò)度表達(dá)的Bcl-2能抑制線粒體的通透性，阻止細(xì)胞色素C等凋亡蛋白釋放到胞質(zhì)中從而抑制細(xì)胞凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胰腺癌細(xì)胞株BxPC3過(guò)度表達(dá)XAF1后，Bcl-2的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，說(shuō)明線粒體途徑也可能參與XAF1誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的凋亡。

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2008-12-10)

(本文編輯：呂芳萍)

XAF1genemediatedbyrecombinantadenovirusinducesapoptosisinpancreaticcelllineBxPC-3

HUANG Jia,ZHU Qi,CAO Hai-xia,YAO Wei-yan,ZHANG Yong-ping,YUAN Yao-zong.

Department of Gastroenterology, Ruijin Hospital,Medical School, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025,China

ZHUQi,Emailzhuqi@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate whether expression of XAF1 mediated by adenovirus vector Ad5/F35 could induce apoptosis in pancreatic cancer cell line BxPC-3 and its possible mechanisms.MethodsPre-constructed recombinant Ad5/F35-XAF1 virus and negative control Ad5/F35-Null was tranfected into BxPC3; the expression of XAF1 mRNA and protein before and after tranfection was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and Western blot. The expressions of proteins including Caspase-3, PARP, Caspase-8 and bcl-2 were detected by Western blots. Cell apoptosis was assessed by Annexin-V/PI and TUNEL staining.ResultsAfter Ad5/F35-XAF1 tranfection, XAF1 mRNA and protein expression significantly increased, and the difference was statistically significant when compared with control group and Ad5/F35-Null group (Plt;0.05). The apoptosis rate was (19.90±3.09)% and (9.29±2.13)%, which was significantly different (Plt;0.01) from those in the Ad5/F35-Null group [(6.72±0.7)6%, (2.73±0.51)%] or in the control group [(7.22±1.53)%, (1.56±0.47)%]. The expression of Caspase-3, PARP and Caspase-8 significantly increased, but the expression of bcl-2 decreased.ConclusionsXAF1 plays a major role in the apoptosis of pancreatic cancer that acts through the activation of death receptor pathway and mitochondrial pathway of apoptosis.

Pancreatic neoplasms; Adenoviruses; XAF1 genes; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.016

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科

諸琦，Email:zhuqi@medmail.com.cn