胰淀粉樣多肽在糖尿病及胰腺癌患者胰腺組織中的表達

崔楠 鄒大進

胰淀粉樣多肽在糖尿病及胰腺癌患者胰腺組織中的表達

崔楠 鄒大進

目的檢測胰淀粉樣多肽(IAPP)在胰腺癌患者胰腺組織中的表達,探討胰腺癌與糖尿病的相關性。方法收集28例手術切除的胰腺癌及其相應癌旁正常胰腺組織，其中12例患者合并糖尿病，16例不合并糖尿病。采用免疫組化和蛋白質印跡法(Western blotting)檢測組織標本中IAPP的表達。結果IAPP定位表達于人胰腺的胰島細胞胞質內。合并糖尿病的胰腺癌組織及癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及癌旁胰腺組織IAPP表達的免疫組化指數分別為283 305±91 627、122 874±86 917、154 032±81 097和105 797±67 593；IAPP相對表達量分別為(173.1±23.5)%、(119.4±18.4)%、(148.7±28.3)%和100%。胰腺癌組織的IAPP表達均顯著高于相應癌旁正常胰腺組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌組織的IAPP表達顯著高于不合并糖尿病的胰腺癌組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的癌旁胰腺組織的IAPP表達高于不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(Plt;0.05) 。結論IAPP 與糖尿病及胰腺癌的發病密切相關，很可能為兩種疾病的共同發病機制之一。

胰腺腫瘤； 糖尿病，2型； 胰淀粉樣多肽； 免疫組織化學； 印跡法，蛋白質

胰島淀粉樣多肽 (islet amyloid polypeptide，IAPP)，又稱胰淀素(amylin),是進食后同胰島素一起由胰島β細胞分泌的肽類激素，是胰島淀粉樣蛋白沉積的主要和獨特成分。尸檢證實，50%～90%的2型糖尿病患者可發生胰島淀粉樣病變[1,2]。在2型糖尿病的猴子和貓的動物模型中，也發現了胰島淀粉樣病變[3,4]，但在小鼠和大鼠中則無此現象，表明胰島淀粉樣病變與動物種屬有關。也有研究表明[5]，合并糖尿病的胰腺癌患者血漿IAPP的濃度明顯高于正常人及其他腫瘤患者，但IAPP在人胰腺組織及胰腺癌組織中的表達鮮見報道。因此，我們檢測IAPP在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中的表達及其與血糖的關系，探討IAPP在胰腺癌合并糖尿病發生中的作用。

材料與方法

一、組織標本

所有標本均取自2006年10月至2007年5月第二軍醫大學附屬長海醫院普外科手術切除的28例胰腺癌組織及相應癌旁正常胰腺組織，標本均經病理學確診,均有完整的手術記錄資料及臨床資料，所有患者均術前簽署知情同意書。12例患者合并糖尿病(符合1999年WHO 2型糖尿病診斷標準)，16例患者血糖正常。分為合并糖尿病的胰腺癌組織、合并糖尿病的癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及不合并糖尿病的癌旁胰腺組織4組。

二、IAPP檢測

采用ABC法檢測。兔抗人Amylin單克隆抗體(Serotec公司)1∶100稀釋，生物素標記二抗及辣根酶標記鏈霉卵白素相繼室溫孵育后DAB顯色。應用MIQAS醫學圖像定量分析系統、 醫學圖像定量分析軟件分析視野中陽性區域面積以及光密度(A)值，兩者乘積為免疫組化指數。每張切片分析3個視野。

同時采用蛋白質印跡法(Western blotting)半定量測定IAPP的表達。新鮮胰腺癌及癌旁正常胰腺組織制備勻漿，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，按Amersham Phamacia公司Hybond ECL操作說明進行轉膜。加入兔抗人Amylin多克隆抗體(Abcam公司)和辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶25 000稀釋)，最后ECL發光。用Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad)灰度掃描X線膠片。以β-actin作為內參照，目的蛋白相對表達量以目的蛋白與β-actin灰度值之比表示。將不合并糖尿病的癌旁正常胰腺組織的目的條帶相對表達量設為100%，計算其他各組與其的比值。

三、統計學處理

結 果

一、一般臨床資料

12例合并糖尿病的胰腺癌患者，糖尿病史(2.1±0.8)年，HbA1c 8.36±2.4，其中男8例，女4例，年齡(59±8)歲，體重指數(23.6±3.1)kg/m2，收縮壓(129±16)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓(84±8)mm/Hg，三酰甘油(1.42±0.53)mmol/L；16例不合并糖尿病的胰腺癌患者，男6例，女10例，年齡(59±6)歲，體重指數(22.9±2.9)kg/m2，收縮壓(125±17)mmHg，舒張壓(78±9)mmHg，三酰甘油(1.23±0.36)mmol/L。兩組間無顯著差異。

二、IAPP在胰腺組織中的表達

免疫組化染色顯示，胰腺癌及其癌旁正常胰腺組織中的胰島細胞胞質內可見棕黃色陽性顆粒，而非胰島細胞區域未見明顯陽性深染區，不合并糖尿病的癌旁胰腺組織中的胰島的染色程度明顯弱于其他3組(圖1)。合并糖尿病的胰腺癌組織、癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及癌旁胰腺組織的免疫組化陽性指數分別為283 305±91 627、122 874±86 917、154 032±81 097和105 797±67 593。不管是否合并糖尿病，胰腺癌組織的免疫組化指數均顯著高于相應癌旁正常胰腺組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌組織的免疫組化指數顯著大于不合并糖尿病的胰腺癌組織；而癌旁胰腺組織間的免疫組化指數無顯著差異。

Western blotting檢測與免疫組化結果一致(圖2)。合并糖尿病的胰腺癌組織及其癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及其癌旁胰腺組織的IAPP相對表達量分別為(173.1±23.5)%、(119.4±18.4)%、(148.7±28.3)%和100%，不管是否合并糖尿病，胰腺癌組織的IAPP相對表達量均顯著高于相應癌旁正常胰腺組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌組織的IAPP相對表達量顯著大于不合并糖尿病的胰腺癌組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的癌旁胰腺組織的IAPP相對表達量顯著大于不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(Plt;0.05)。

圖1合并糖尿病的胰腺癌組織(A)、合并糖尿病的癌旁胰腺組織(B)、不合并糖尿病的胰腺癌組織(C)及不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(D)的IAPP表達(免疫組化 ×400)

圖2合并糖尿病的胰腺癌組織(A)、合并糖尿病的癌旁胰腺組織(B)、不合并糖尿病的胰腺癌組織(C)及不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(D)的IAPP表達(Western blotting)

討 論

早在20世紀70年代就有研究顯示，80%的胰腺癌患者確診時已經發生了2型糖尿病或糖耐量異常[6],其后也有多項研究證實，胰腺癌與糖尿病及糖耐量異常密切相關[7]。1995年發表的納入20個臨床研究的薈萃分析顯示，病程在5年以上的糖尿病患者中，胰腺癌的發病危險高于正常人群的2倍[8]，近年來發表的納入50多個臨床研究的多個薈萃分析也得出了相同的結論[9-10]。盡管多項流行病學資料顯示糖尿病和胰腺癌有密切的相關性，但是使二者密切相關的因素及機制目前還不十分清楚。

以IAPP為主要成分的胰島淀粉樣蛋白沉積是2型糖尿病的一個典型病理特征。動物實驗發現,猴和貓的自發性糖尿病模型胰腺體內都能形成胰島淀粉樣蛋白沉積,這些動物模型具有與人類2型糖尿病相似的癥狀,如發病年齡相對較大,伴有肥胖,由糖耐量異常發展為高血糖狀態,最終依賴胰島素治療。Wang 等[11]通過對高表達hIAPP的轉基因小鼠研究發現,當80%的β細胞不同程度受累時,約1.5%的β細胞被淀粉樣沉積物代替,而當所有的細胞均受累時,約有10%的細胞被沉積物取代,此時,轉基因小鼠表現出輕度胰島素分泌功能受損,空腹血糖仍在正常范圍。隨著更多的β細胞被淀粉樣沉積物取代,小鼠的血糖逐漸升高直至必須依賴胰島素治療。表明胰島淀粉樣蛋白沉積破壞了胰島β細胞,造成β細胞功能受損，發生糖耐量異常進而導致糖尿病,因此,動物的胰島淀粉樣沉積可視為糖耐量異常和糖尿病的原因。

人類胰島淀粉樣蛋白沉積與糖耐量的關系比動物復雜得多,由于胰島淀粉樣蛋白沉積必須通過病理檢查才能證實,這在人類很難做到。現有的尸體解剖雖然發現76%～90%的2 型糖尿病患者存在胰島淀粉樣蛋白沉積,而非糖尿病者只有0～50%發生胰島淀粉樣蛋白沉積[12-15],但是2 型糖尿病患者胰島淀粉樣蛋白沉積的輕重程度有很大差異,受累的胰島β細胞范圍為lt;1%～gt;80%,單個β細胞淀粉樣變的嚴重程度差別也非常大。

許多研究表明，IAPP與胰腺癌及糖尿病的發病密切相關。Ding等[16]將β細胞暴露于胰腺癌細胞條件培養液中可以選擇性地刺激β細胞分泌IAPP。Permert 等[5]研究發現胰腺癌合并糖尿病的患者血漿IAPP濃度明顯高于非腫瘤人群及血糖正常人群，而胰腺癌組織中IAPP的表達水平低于癌旁胰腺組織以及正常胰腺組織，癌旁胰腺組織的胰島B細胞IAPP表達也明顯減少，作者認為IAPP在B細胞內產生但并沒有正常地儲存，這可能是外周血IAPP濃度升高的原因。他們[17]又通過導管細胞專一致癌物BOP誘導敘利亞金倉鼠發生胰腺癌，誘導后12周的血漿胰高糖素水平明顯升高，誘導27周后，血漿胰島素水平及IAPP水平明顯升高，而胰腺組織IAPP濃度卻明顯降低，只有對照組的44%，進一步證實上述觀點。

M?kimattila等[18]報道，血糖正常的胰腺癌患者的血漿IAPP水平明顯升高，而合并糖尿病的胰腺癌患者IAPP水平降低，從而認為IAPP與胰島素的比值增高可以作為一個預測血糖正常的患者發生胰腺癌的檢測因子。Chari等[19]報道，胰腺癌患者血漿IAPP濃度明顯高于非胰腺癌患者，而且合并糖尿病者血漿IAPP濃度增高更加明顯。

本實驗結果顯示，胰腺癌組織及癌旁胰腺組織的胰島細胞均有IAPP的表達，癌組織IAPP的表達強于癌旁胰腺組織；合并糖尿病者的表達強于不合并糖尿病者，與Permert等[5]的結論不一致。Katsumichi等[20]檢測正常人胰腺、糖尿病胰腺組織、胰腺癌組織及癌旁胰腺組織IAPP的表達，結果在胰腺癌組織的胰島細胞中并未發現胰島淀粉樣變，而糖尿病患者的胰島內均存在不同程度的淀粉樣變，結果也不一致。分析原因可能與種族差異有關，但需要進一步證實。

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2008-08-11)

(本文編輯：屠振興)

Expressionofisletamyloidpolypeptideinpancreasofpatientswithdiabetrsandpancreaticcancer

CUINan,ZHOUDa-jin.

DepartmentofEndocrine,ChanghaiHospital,SecondMillitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo detect the expression of islet amyloid polypeptide (IAPP) in the pancreatic tissues of patients with pancreatic cancer, and to explore the relation between diabetes and pancreatic cancer.MethodsSurgically-removed 28 pancreatic cancer samples and adjacent normal pancreatic tissues were studied. Among these patients there were 12 patients complicated with diabetes while other 16 patients did not. Immunohistochemical method and Western blot method were used to detect the expression of IAPP in different tissue specimens.ResultsIAPP expressed in human pancreatic islet cell cytoplasm. Immunohistochemical index of pancreatic cancer and adjacent normal pancreatic specimens of patients with diabetes, and pancreatic cancer and adjacent normal pancreatic specimens of patients without diabetes were 283 305±91 627, 122 874±86 917, 154 032±81 097 and 105 797±67 593, respectively; the relative IAPP expressions were (173.1±23.5)%, (119.4±18.4)%, (148.7±28.3)% and 100%. Irrespective of the presence of diabetes, expression of IAPP in pancreatic cancer specimens was significantly higher than that in adjacent normal pancreatic specimens (Plt;0.01); expression of IAPP in pancreatic cancer plus diabetes specimens was significantly higher than that in pancreatic cancer specimens without diabetes (Plt;0.01); expression of IAPP in adjacent pancreatic specimens complicated with diabetes was significantly higher than that in adjacent pancreatic specimens without diabetes (Plt;0.05).ConclusionsIAPP participated in the course of diabetes and pancreatic cancer, and may be the common pathogenesis of the two diseases.

Pancreatic neoplasms; Diabetes mellitus, type 2; Islet amyloid polypeptide; Immunohistochemistry; Boltting, western

Correspondintauthor:ZHOUDa-jin,Email:zwdj22@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.015

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院內分泌科

鄒大進，Email: zwdj22@medmail.com.cn