關節炎患者血清葡萄糖－６－磷酸異構酶活性及抗原含量檢測

科研項目 河南省教育廳自然科學研究項目(項目批準編號2007320020)

摘 要 目的:研究不同類型關節炎患者血清中葡萄糖-6-磷酸異構酶(G6PI)抗原含量和酶活性水平的差異，觀察類風濕關節炎(RA)患者血清中G6PI抗原含量和活性是否有相關性，探討RA患者G6PI抗原含量升高機制。方法:對172例臨床已確診的不同類型關節炎患者和20例健康人，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和速率法分別測定各例患者血清中G6PI抗原含量和酶活性。結果:56例RA患者血清中G6PI抗原含量為3.009μg/ml，活性為164.575U/L;116例非RA關節炎患者血清中G6PI抗原含量為0.019μg/ml，活性為65.6U/L;健康對照組血清中G6PI抗原含量為0.0135μg/ml，活性為67.72U/L。結論:RA患者與其他關節炎患者相比，G6PI抗原含量顯著增高，有診斷價值;RA患者G6PI抗原含量和活性之間無相關性，r=0.007;G6PI活性:SLE>AS>RA>其他關節炎;用免疫方法檢出的G6PI可能是具有酶活性G6PI的互補蛋白。

關鍵詞 關節炎 葡萄糖-6-磷酸異構酶 含量活性 互補蛋白

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.20.243

資料與方法

標本:來自本院風濕實驗室血清庫和鄭州大學第一附屬醫院腎病風濕科。已確診的RA患者56例，強直性脊柱炎(AS)25例，系統性紅斑狼瘡(SLE)25例，晶體性關節炎(Crys.原發性痛風)20例，骨性關節炎(OA)20例，外傷性關節炎(Tr)22例，結核性關節炎(TB)4例。

將172例分為兩組:①類風濕關節炎患者。②非類風濕關節炎患者:包括包括強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、原發性痛風、骨性關節炎、外傷性關節炎、結核性關節炎。所有風濕病患者均符合美國風濕病協會(ACR)修訂的診斷分類標準。選擇20例健康人血清作為正常對照。

試劑:北加生化試劑有限公司生產的G6PI抗原ELISA含量測定試劑盒;匯力生物技術有限公司生產的G6PI活性測定試劑盒。

采用ELISA雙抗體夾心法檢測人血清中的G6PI抗原含量。將172例患者和20例健康人血標本編號，離心，分離血清。操作步驟:在已包被G6PI抗體的聚苯乙烯微孔板上設G6PI標準品5孔及空白孔1孔，其余依次加待檢人血清樣品，每孔加樣100μl。37℃放置1小時，取出洗滌5次，拍干。除空白孔外，其余各孔加酶標記抗體100μl，37℃放置1小時，取出洗滌5次，拍干。各孔加底物顯色液100μl，室溫避光保持15 分鐘。各孔加終止液50μl。結果判斷:采用奧地利HT3型自動酶標儀主波長492nm，副波長620nm，以G6PI標準品0.00mg/L校零，測定各孔吸光度值，以G6PI標準品標示值為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線(標準曲線見圖)。以待檢各孔吸光度值查標準曲線，得出相應的檢測結果。超過線性范圍時，對血清稀釋結果×稀釋倍數。酶標儀采用安圖生物工程有限公司配套電腦軟件。

測定血清G6PI活性的方法:原理:果糖-6-磷酸-G6PI→葡萄糖-6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸+NADP→NADPH。在340nm波長，測定每分鐘NADPH的吸光度變化值乘以因數計算活性。以國際單位表示。

測量參數:樣品量25μl，試劑量500μl，反應方向正，測量時間60秒，延遲時間60秒，溫度37℃，波長340nm，因數3333。在日本島津CL-770自動分光光度計上操作。參考范圍:8～54U/L。

統計學處理:用SPSS13.0軟件進行統計學分析，由于血清中的G6PI不屬于正態分布，用秩和檢驗對數據進行分析。

結 果

不同組血清中G6PI抗原含量，見表1。

如表所示:RA患者G6PI抗原含量均值顯著高于非類風濕關節炎和健康對照，非類風濕關節炎各組G6PI抗原含量變化不大。

不同組血清中G6PI活性，見表2。結果顯示:SLE患者血清中的G6PI活性為201.60U/L顯著高于RA患者活性164.575U/L和AS患者活性188.70U/L;RA患者與AS患者G6PI活性無明顯差別(P﹥0.05);RA患者與健康對照組G6PI活性無明顯差別(P≥0.05);RA，AS，SLE三組病人G6PI活性與OA，Tr，TB，Crys患者相比有顯著性差異(P=0.000)，RA與非RA患者G6PI活性有顯著性差異(P=0.000)。

RA患者G6PI活性與G6PI抗原含量采用pearson檢驗，r=0.007，P=0.959，無統計學意義，可見RA患者G6PI活性與G6PI抗原無相關性。

討 論

2001年Schaller等首次報道抗葡萄糖-6-磷酸異構酶(G6PI)G6PI作為一種酶，在RA患者血清中其酶活性是否升高，與G6PI抗原含量之間是否有相關性，G6PI在其他一些關節疾病如原發性痛風、骨性關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡等疾病中含量和活性是否升高，國內尚未見報道。

本文采用ELISA雙抗體夾心法和速率法同步檢測不同類型關節炎患者血清G6PI抗原的含量和G6PI酶活性。結果發現，RA患者G6PI抗原含量均值顯著高于非類風濕關節炎和健康對照。非類風濕關節炎各組G6PI抗原含量變化不大。SLE患者血清中的G6PI活性為201.60U/L顯著高于RA患者活性164.575U/L和AS患者活性188.70U/L;RA患者與AS患者G6PI活性無明顯差別;RA患者與健康對照組G6PI活性無明顯差別;RA、AS、SLE三組病人G6PI活性與OA、Tr、TB、Crys患者相比差異有顯著性(P=0.000)，RA與非RA患者G6PI活性有顯著性差異(P=0.000)。RA患者G6PI活性與G6PI抗原含量采用pearson相關分析，無相關性，r=0.007，P=0.959，RA患者G6PI活性與G6PI抗原含量無統計學意義。此結果與Monica Schaller等[4]報道一致。

G6PI作為細胞因子和生長因子參與一系列廣泛的胞外代謝。G6PI的多種細胞外功能包括:提高運動和感官神經元在體外的存活率;刺激B細胞產生免疫球蛋白;是腫瘤細胞的產物，促進腫瘤細胞的轉移;有助于原始粒細胞和成熟單核細胞的鑒別;是精子發生凝聚的主要表面抗原物質。G6PI為何有這么廣泛的功能目前還不太清楚。G6PI的基因位于第19號染色體上，基因全長超過40Kb，含有18個外顯子和17個內含子。根據T細胞受體轉基因小鼠(K/B×N)模型，G6PI作為一種自身抗原誘導T細胞和B細胞產生抗G6PI抗體，被動轉移抗G6PI自身抗體可引起接種動物關節炎，G6PI同時作為自身抗原與抗G6PI自身抗體結合形成免疫復合物，引起關節癥狀的進一步加重。雖然抗G6PI抗體可能對RA的診斷無幫助，但RA病人血清和關節液中明顯增高的G6PI抗原可能對RA的診斷有幫助，或者能成為RA病人病情活動指標之一。本文通過一系列試驗及數據整理分析，發現與其他非類風濕關節炎患者相比，RA患者G6PI抗原含量明顯升高，支持多位學者G6PI抗原含量檢測可用于診斷RA的結論。發現RA，AS，SLE三組病人G6PI活性與OA，Tr，TB，Crys患者相比有顯著性差異(P﹤0.01)，確切原因不清，可能是因自身免疫因素所致關節炎患者基因調控紊亂或糖酵解加強導致G6PI合成增加，從而活性增加。此外，G6PI是一糖代謝酶，缺氧增加了炎癥相關的新陳代謝需求，細胞增殖超過了血管生成，血供減少更引起了炎癥，從而加重RA的病情。G6PI活性:SLE>AS>RA>其他關節炎。G6PI活性檢測似可作為RA等自身免疫因素所致關節炎患者炎性程度的一個指標。

G6PI抗原含量和活性之間并無明顯相關性。分析有一下原因:①G6PI在血清中的存在形式有三種:四聚體，二聚體和單體，僅二聚體形式有酶活性，單體形式的G6PI是一種細胞活性因子。G6PI是B淋巴細胞和T淋巴細胞分泌的一種自身抗原，與免疫因素密切相關，當各種形式的G6PI形成抗原抗體免疫復合物時就失去了活性。而RA患者血清和關節液中含有大量的G6PI免疫復合物，這類G6PI在酶活性試驗中就無法測出。而用ELISA法檢測G6PI含量時測出的則是所有含G6PI的多種形式的G6PI，因此含量往往升高。②根據Pendergraft等自身免疫病發病機制獨特型網絡理論，還可有另外一種解釋，用免疫方法檢出的G6PI是具有酶活性的G6PI的互補蛋白，是由具有酶活性的G6PI基因的反義鏈編碼的蛋白。尤其是那些由-1讀碼框架轉錄翻譯而來的蛋白。這種互補蛋白可以由內源性的反義或者由外源性的細菌或真菌的自身抗原(G6PI)編碼同源序列翻譯生成。這種互補蛋白誘發獨特型-抗獨特型抗體網絡反應，產生的抗獨特型抗體能夠與自身抗原反應從而誘發自身免疫性疾病——RA。這個獨特型-抗獨特型抗體網絡過程被稱為“自身抗原互補性”。換言之，導致自身免疫病(RA)的級聯事件的起始物是內原性或外原性“G6PI”的互補蛋白。本文結果支持這一理論。用免疫方法檢出的這種只在RA患者血清中檢出的所謂“葡萄糖-6-磷酸異構酶，G6PI”與參與糖代謝的“葡萄糖-6-磷酸異構酶，G6PI”不是一種物質。RA患者血清中“G6PI”應稱為葡萄糖-6-磷酸異構酶互補蛋白，G6PI互補(反義)蛋白。參與糖代謝的G6PI才是真正的“葡萄糖-6-磷酸異構酶”。

參考文獻

1 Schaller M，Burton DR，Ditzel HJ.Autoantibodies to GPI in rheumatoid arthritis:linkage between an animal model and human disease.Nat Immunol，2001，2(8):746-753.

2 鮑春德，葉萍，陳曉翔，等.血清中6-磷酸葡萄糖異構酶抗原升高在類風濕關節炎中的意義探討.中華風濕病學雜志，2005，9(5):277-279.

3 郭品娥，沈茜，郝怡鑫，等.血清6-磷酸葡萄糖異構酶水平對類風濕關節炎的診斷價值.診斷學理論與實踐，2005，4(6):466-468.

4 李軍，魏署亞，侯蓉，等.磷酸己糖異構酶測定方法的改進及對惡性腫瘤診斷價值的探討.腫瘤防治雜志2000，7(5):449.