疾病控制中心的ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)室管理要素

摘 要 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)和動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域，因此建立PCR實(shí)驗(yàn)室，必須要按照相關(guān)的法規(guī)進(jìn)行嚴(yán)格科學(xué)的管理。本文對(duì)疾病控制中心的PCR實(shí)驗(yàn)室的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域的設(shè)置、人員的管理和培訓(xùn)、污染及處理污染的措施、質(zhì)量管理體系的建立及質(zhì)量控制、樣本的采集與處理、儀器設(shè)備的校準(zhǔn)及保養(yǎng)維護(hù)、實(shí)驗(yàn)室安全等幾方面的管理要素進(jìn)行了分析，其目的是為臨床檢測(cè)和診斷提供更加科學(xué)和準(zhǔn)確的報(bào)告。

關(guān)鍵詞 聚合酶鏈反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)室 質(zhì)量管理

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.11.222

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域的設(shè)置

熒光PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)置是一個(gè)很規(guī)范的要求，應(yīng)遵守相關(guān)法規(guī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置。總的方針是各區(qū)獨(dú)立，注意風(fēng)向，因地制宜，方便工作。實(shí)驗(yàn)室裝修應(yīng)方便清潔，不應(yīng)出現(xiàn)死角。熒光PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。各工作區(qū)域必須要有明確的標(biāo)記，進(jìn)入各工作區(qū)域嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，只能從試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)這樣一個(gè)行程進(jìn)行。最好做到專區(qū)專人，區(qū)內(nèi)物品專用。各區(qū)應(yīng)具備的設(shè)備配置：屋頂紫外燈、近臺(tái)紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、廢液缸、掃帚、拖把、廢紙簍、微量加樣器覆蓋1～1000L、經(jīng)高壓處理過(guò)的離心管和加樣器吸頭、筆、紙等，注意避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。

人員的管理和培訓(xùn)

從事PCR實(shí)驗(yàn)室工作人員，應(yīng)具備醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和微生物檢驗(yàn)的基本知識(shí)，且是受過(guò)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)知識(shí)和技能的培訓(xùn)并獲得上崗證書(shū)的人員。中心主任要親自負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室全面管理、技術(shù)指導(dǎo)、解決與溝通技術(shù)疑難等問(wèn)題。同時(shí)為了加強(qiáng)專業(yè)知識(shí)和技能的訓(xùn)練，中心要不定期外請(qǐng)專業(yè)人員進(jìn)行培訓(xùn)和派送相關(guān)人員外出學(xué)習(xí)，做好后備人員的培養(yǎng)。要求PCR實(shí)驗(yàn)室人員定期寫學(xué)術(shù)綜述或經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，能夠順利地通過(guò)國(guó)家設(shè)立的定期考核。對(duì)PCR的原理、應(yīng)用范圍、局限性及發(fā)生污染的每一個(gè)環(huán)節(jié)要有充分的了解，熟悉操作規(guī)程，善于分析試驗(yàn)結(jié)果。要建立技術(shù)人員檔案，做好對(duì)本室人員的管理。

污染及處理污染的措施

熒光PCR的污染分為實(shí)驗(yàn)前的污染和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中的污染。實(shí)驗(yàn)前的污染是指實(shí)驗(yàn)材料的污染，主要是病人標(biāo)本來(lái)源的核酸；而實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中的污染，通常實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一步驟都可能發(fā)生對(duì)樣本的污染。核酸的制備是較常產(chǎn)生污染的過(guò)程，熒光PCR反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位，也是可能的污染源。而PCR產(chǎn)物是個(gè)高度危險(xiǎn)的污染源，通常的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物含有大量的目標(biāo)模板分子，極易泄露產(chǎn)生氣溶膠污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。在日常工作中需要加強(qiáng)對(duì)污染的監(jiān)測(cè)，每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做各種陰陽(yáng)性對(duì)照。①陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好的模板進(jìn)行，監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)是否成功且是否合乎理論要求。②標(biāo)本對(duì)照：被檢測(cè)的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照。③試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑及環(huán)境是否污染。有時(shí)輕微的氣溶膠污染還需要復(fù)管試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)等。所以實(shí)驗(yàn)室所有人員應(yīng)充分認(rèn)識(shí)預(yù)防污染的重要性，了解產(chǎn)生污染的原因，如：①標(biāo)本間交叉污染。在核酸提取過(guò)程中一定要小心操作，防止飛濺，做好標(biāo)記，避免樣本間的交叉污染。配好反應(yīng)液并加入待測(cè)核酸后，必須蓋好反應(yīng)管，要有明確的樣品處理程序。②PCR試劑的污染。主要是由于在PCR試劑的配置過(guò)程中加樣槍、容器、雙蒸水及其他溶液被PCR核酸模板污染。③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。主要是氣溶膠污染，一定要選用質(zhì)量好的離心管和反應(yīng)管，避免試劑飛濺、外泄。同時(shí)必須要有高度的責(zé)任感，反應(yīng)完畢后應(yīng)及時(shí)把反應(yīng)物清理掉，避免熒光PCR后的產(chǎn)物反應(yīng)管在工作區(qū)內(nèi)打開(kāi)。

要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染。實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的就是為了預(yù)防污染，工作區(qū)之間傳遞窗的設(shè)置，一方面方便了試劑、樣品等在不同實(shí)驗(yàn)室區(qū)間的傳遞；另一方面也增加了交叉污染的危險(xiǎn)，因此要定期對(duì)傳遞窗進(jìn)行處理或用移動(dòng)紫外燈照射。工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔，用10%次氯酸鈉擦拭，再用70%乙醇擦拭，然后再用可移動(dòng)紫外燈調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60～90cm內(nèi)過(guò)夜照射，可有效打斷擴(kuò)增產(chǎn)物。一旦污染發(fā)生，應(yīng)立即進(jìn)行清潔衛(wèi)生、稀鹽酸液擦拭或浸泡、通風(fēng)疏散、紫外燈照射、酸霧處理等措施，盡快消除污染。也可選用不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，盡快恢復(fù)正常工作狀態(tài)。造成熒光PCR污染的原因很多也較復(fù)雜的，因此必須對(duì)熒光PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的科學(xué)管理。

質(zhì)量管理體系的建立及質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系包括三部分：即質(zhì)量方針與宗旨、工作制度、標(biāo)準(zhǔn)操作文件(SOP)。基本內(nèi)容也可概括為四句話“寫你所應(yīng)做的，做你所寫的，記錄你所做的和分析你所做的”。就是要寫質(zhì)量管理文件，并把實(shí)驗(yàn)室的工作文件化，寫的要具體一些，讓第一次接觸該SOP的人，也能夠按其完成相關(guān)操作。文件的編寫是實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收工作最重的一個(gè)環(huán)節(jié)，所以在編寫文件時(shí)要讓每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的人員都參與，對(duì)所寫的內(nèi)容、程序和要求都知道，并能遵守執(zhí)行。要做到這一點(diǎn)，除了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度外，關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人和實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的觀念，要認(rèn)識(shí)到SOP文件對(duì)質(zhì)量保障的重要性。質(zhì)量管理精髓是所有與實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)質(zhì)量有關(guān)的環(huán)節(jié)全部要有章可循，按章進(jìn)行。

質(zhì)量控制包括兩個(gè)方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。室內(nèi)質(zhì)量控制(IQC)的目的是確保臨床測(cè)定過(guò)程及結(jié)果在偏差和精密度方面達(dá)到預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)；室間質(zhì)量控制(EQC)是將實(shí)驗(yàn)室測(cè)定情況與一室間和客觀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回顧性比較的數(shù)據(jù)。所有開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，都必須參加由衛(wèi)生部組織的全國(guó)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果將作為其開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的依據(jù)之一。臨床標(biāo)本制備處理和核酸提取方法的標(biāo)準(zhǔn)化、檢測(cè)試劑和方法的標(biāo)準(zhǔn)化是室間控制的關(guān)鍵。應(yīng)在常規(guī)工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)行IQC以監(jiān)測(cè)方法或者檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，通過(guò)室內(nèi)質(zhì)控系統(tǒng)，使用質(zhì)控品，確定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，可以評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果的精密度，結(jié)合室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(EQA)可以評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)有效的質(zhì)量控制，充分運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的靈敏性、特異性和高效性，為臨床檢測(cè)和診斷提供科學(xué)和準(zhǔn)確的報(bào)告，真正實(shí)現(xiàn)為患者及社會(huì)公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)服務(wù)的宗旨。

樣本的采集與處理

常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或者是枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、CSF、尿及分泌物、各種食品樣本等。標(biāo)本的收集應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域之外進(jìn)行，樣本采集后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分離、微生物細(xì)菌培養(yǎng)等處理，暫不進(jìn)行試驗(yàn)的樣本應(yīng)處于合適的溫度條件下保存并明確保存期限，及時(shí)檢測(cè)。對(duì)樣本編號(hào)應(yīng)有明確規(guī)定，保證編碼的惟一性，不能有重復(fù)編號(hào)，樣本資料信息登記要完整，方便查找。采血液樣本時(shí)，應(yīng)用一次性密閉容器。非密閉采集樣本時(shí)，必須防止來(lái)自采樣者的皮屑或分泌物的污染，采樣時(shí)必須戴一次性手套、帽子。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，可使核酸酶永久性失活。進(jìn)行抗凝處理時(shí)，不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的強(qiáng)抑制劑。

儀器設(shè)備的校準(zhǔn)及保養(yǎng)維護(hù)

儀器性能穩(wěn)定調(diào)試校準(zhǔn)，是試驗(yàn)操作的前提條件，加樣槍應(yīng)及時(shí)的校準(zhǔn)及保養(yǎng)維護(hù)，PCR檢測(cè)儀每年應(yīng)由儀器廠家對(duì)儀器進(jìn)行檢修和校準(zhǔn)；對(duì)冰箱和加熱模板應(yīng)每日記錄其溫度，有效地控制實(shí)驗(yàn)的條件；其他設(shè)備要經(jīng)常清潔衛(wèi)生，避免塵埃或核酸分子沉積。塵埃分子等對(duì)熒光反射有一定得影響，最好應(yīng)避免在塵埃數(shù)過(guò)高的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。及時(shí)升級(jí)或更新已老化的儀器設(shè)備，保證PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。

實(shí)驗(yàn)室安全

PCR實(shí)驗(yàn)室的安全包括實(shí)驗(yàn)室的生物防護(hù)、實(shí)驗(yàn)室的清潔、實(shí)驗(yàn)室污染的處理、實(shí)驗(yàn)廢棄物的處理等。生物防護(hù)除了必備的口罩、帽子、手套、工作服外，還應(yīng)具備洗眼瓶、75%酒精、眼罩、生物安全柜等設(shè)施，并制定緊急情況處理方案。如不慎將血液標(biāo)本、體液標(biāo)本或其他病原微生物濺到皮膚上，應(yīng)立即用清水反復(fù)沖洗，接著用75%酒精棉簽或含碘消毒棉簽擦拭消毒，最后再用清水沖洗干凈。要防止污物處理不規(guī)范、檢驗(yàn)人員自我防護(hù)措施不嚴(yán)、日常消毒滅菌不能堅(jiān)持、人員通行混亂、工作記錄不全、實(shí)驗(yàn)方法未按SOP文件程序操作、質(zhì)量控制未按要求執(zhí)行等等。

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)，不僅需要健全的實(shí)驗(yàn)室制度與實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立，而且需要對(duì)各種有關(guān)條例、規(guī)范等的貫徹和實(shí)施，從而做到真正意義上的基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，這不僅可為公共衛(wèi)生、臨床及患者提供準(zhǔn)確、公正、及時(shí)、有效的檢測(cè)報(bào)告，也為今后實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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