西瓜花藥培養技術研究進展

摘要：花藥培養是作物育種中一種重要的輔助育種技術。文章對影響西瓜花藥培養的主要因素。如基因型、小孢子發育時期、培養基、碳源、生長調節劑、活性炭、三十烷醇等研究進展進行了綜述，并針對西瓜花藥培養中存在的問題提出了今后研究的方向。

關鍵詞：西瓜；花藥培養；基因型；培養基；碳源；生長調節劑；活性炭

西瓜(Citrullus lanatus)又稱夏瓜、寒瓜，堪稱瓜中之王。因在漢代從西域引入，故稱西瓜。屬葫蘆科，西瓜屬，一年生草本植物。與大多數作物相比，西瓜品種間同源性較高，遺傳基礎非常狹窄，所以，有必要拓寬西瓜的種質遺傳基礎，為遺傳育種做貢獻。單倍體尤其是雙單倍體與分子生物學、基因工程、誘變育種相結合，可以加速育種進程，并能更好地改良西瓜遺傳基礎，產生更多的高抗優質高產品種，同時豐富品種的多樣性。單倍體不存在顯隱性問題，產生的隱性突變在第1代即可表現出來。其基因型完全可以由表現型反映出來，有利于鑒定和選擇。再者，利用花藥和花粉培養的胚狀體或愈傷組織不僅可以作為基因工程的受體進行基因轉化，而且可以快速獲得符合育種目標的植株，提高育種效率。

在西瓜上自發產生單倍體的頻率極低，為了獲得西瓜單倍體。國內外研究者主要通過離體雄核發育(in vitro androgenesis，即花粉——小孢子培養)、離體雌核發育(in vitro gynogenesis，即未授粉子房——胚珠培養)以及原位雌核發育(in situparthenogenesis，即用化學試劑、輻射等處理過的花粉授粉誘導)等3種人工誘導途徑獲得單倍體植株。近30年來，國內外研究者在西瓜花粉培養方面做了一些探索研究并取得了初步成功，但由于各種離體誘導條件較難控制且再生植株倍性復雜等原因，高效、穩定的西瓜單倍體培養體系尚未成功建立，還未能有效應用于西瓜育種。

1 試驗材料

1.1 基因型

供體植株的基因型是影響花藥培養的關鍵因素。不同基因型植株花藥對培養基反應是不同的。有些基因型的花藥只對特定培養基有反應，有些材料甚至對某些培養基沒有反應，還有些基因型的花藥則對幾種培養基均有反應。緱艷霞的試驗結果表明3個F₁代雜交品種中，春光和拿比特花藥愈傷組織誘導率顯著高于喜都。在李娟等的試驗中發現，野生品種和栽培品種愈傷組織誘導率有顯著差別，前者要高于后者。

1.2 小孢子發育時期

許多研究表明，花粉的發育階段對誘導雄性單性生殖至關重要，是能否誘導成功及誘導頻率高低的內在因素之一。這關系到是否能產生胚性愈傷組織，進而產生單倍體，也關系到培養條件及培養效果。在大多數作物花藥培養中。花粉的發育時期選用的都是單核靠邊期，但目前對其作用機理還不是很清楚。在黃瓜花藥培養中，不同發育期的花藥幾乎同樣能夠形成愈傷組織。在謝淼等的試驗中卻認為單核中后期的花藥作為外植體較適宜。而甜瓜花藥培養的最佳時期是單核靠邊期到雙核期。1981年薛光榮利用瓊酥西瓜品種，通過培養單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得了西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中獲得了新品種，但是并沒有進行推廣。在確定花粉發育時期時，不能僅憑花蕾大小來判斷。因為花蕾大小因植株生長狀況及采花時期不同，同樣大小的花蕾發育時期也不盡相同。

1.3 材料生長環境

一般認為供體植株的生長環境條件對小孢子活力及培養效果有影響㈣。緱艷霞的試驗說明，在小孢子形成初期整天陰雨連綿。會造成花粉敗育，小孢子的活性就降低，花藥愈傷組織誘導率低和植株再生率低，并且轉移到分化培養基上也容易死亡。此外，光照和光周期也會影響到供體植株花藥培養的胚誘導率、分化率及胚狀體的形成。謝淼等的試驗發現由于季節不同，所接種的黃瓜花藥誘導率不同，春季比秋季的效果好。李娟等在西瓜花藥和小孢子培養研究中說明適宜的生長條件。才更利于西瓜花藥培養胚誘導和植株再生。

2 培養基成分

2.1 基本培養基

大多數瓜類花藥培養都選用MS作基本培養基。也有選用其他培養基。謝淼等選用MS和B5作為基本培養基對黃瓜花藥進行培養。在有關絲瓜花藥培養的研究中選用的是N6。袁萬良等在薛光榮的基礎上，通過改良培養基解決了愈傷組織褐變死亡問題，將分化階段愈傷組織的誘導率從0.5％提高到了94.4％，并快速誘導出了綠色組織。

2.2 生長調節劑

基本培養基能保證培養物的生存與最低生理活動。但只有配合使用適當的外源生長調節劑，才能誘導細胞分裂、愈傷組織生長以及芽、根的分化等。生長素和細胞分裂素在植物不同生長時期的需求配比有所變化，生長調節劑在不同組織培養中的協同作用也對瓜類花藥組織培養有著顯著影響。緱艷霞在西瓜花藥培養中發現2.4－D在西瓜花藥愈傷組織誘導中起著關鍵作用，但其質量濃度超過0.5mg／L時，易形成白化疏松的愈傷組織，沒有分化能力：萘乙酸誘導愈傷組織的作用不強，但是愈傷組織的質量較好，有較高的分化潛力。

2.3 碳源

碳源是植物組織培養不可缺少的物質。它不僅能給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇等。其中蔗糖能支持絕大多數植物離體培養物的旺盛生長，一直被認為是植物組織培養的標準碳源而被廣泛應用。然而近年來。許多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物對不同糖類的反應不完全相同。并且多數植物組織培養物除蔗糖外。在葡萄糖、果糖為碳源時也能生長良好。碳源一般在6％～12％變化范圍內即可滿足瓜類植物營養需求。最近的研究發現，在誘導培養基中糖的類型和濃度可影響雄性單性生殖，不僅影響愈傷組織誘導率，而且還影響愈傷組織的質地和結構。在花藥培養前期。高濃度的蔗糖不僅可誘導花粉胚的形成，而且由于花粉細胞的滲透壓比體細胞的滲透壓高，在一定濃度范圍內能降低花絲等體細胞愈傷組織的發生，從而提高花粉愈傷組織發生的比例：在中后期，降低蔗糖濃度可提高培養基水勢，促進單倍體細胞生長和繁殖，有利于愈傷組織和胚狀體的發育和分化。

2.4 活性炭

加入活性炭的目的主要利用其吸附性，減少有害物質的不利影響，如活性炭能吸附一些酚類物質，可以減輕愈傷組織的褐化，吸收瓊脂中的雜質等。此外，創造暗環境，有利于某些植物生根。但是活性炭也能吸收有益物質，如NAA。KT，6－BA，Fe－EDTA。對于不同材料，活性炭的效果可能不同。而在葫蘆科作物上，喻財鈴和緱艷霞分別在絲瓜和西瓜的試驗中發現加入活性炭效果差，有抑制愈傷組織形成的作用。

2.5 硝酸銀

硝酸銀作為乙烯抑制劑，在組織及細胞培養中能夠促進胚性愈傷組織的形成，并且能促進多胺的合成以提高胚性愈傷組織的形成，進而提高愈傷組織分化頻率。在葫蘆科作物花藥培養中，很少有關于硝酸銀應用的報道。但在其他組織器官培養中有許多報道。曹利仙等發現在黃瓜離體子葉培養中添加2～6mg／L硝酸銀能顯著提高子葉芽的再生頻率。韓麗華將硝酸銀應用于厚皮甜瓜未受精胚珠的離體培養上，發現對誘導單倍體再生植株有一定的作用。

2.6 三十烷醇

三十烷醇在花藥培養中的作用還不太清楚。但三十烷醇生理活性很強，使用濃度較低，具有促進生根、發芽等功用。許多人認為三十烷醇對培養基中的有害物質有一定抑制作用，可促進有效愈傷組織的形成。袁萬良等㈣發現加入一定濃度的三十烷醇，愈傷組織全部變為綠色，并形成深綠色點狀組織，提高了再生植株的誘導率。并且在李娟等H的試驗研究中也發現三十烷醇有此作用，但在緱艷霞和王開凍等㈣的試驗研究中發現三十烷醇只對誘導和保持綠色愈傷組織有利，對促進不定芽形成的作用則不明顯。

3 花藥處理方法

3.1 預處理

花藥經過預處理后再進行培養是花藥培養中比較常見的培養方法。其中包括低溫、高溫、熱激、離心以及甘露醇處理等。大部分葫蘆科作物花藥培養采用低溫對花藥進行預處理，其作用是：(1)引起花藥內源生長調節劑發生變化，進而影響愈傷組織的形成；(2)引起小孢子的孤立化，使花藥壁細胞和絨氈層在低溫預處理過程中退化解體；(3)減緩小孢子退化，保持生活力，使更多的小孢子有機會參與雄核發育。魏瑛的研究表明西瓜花藥在4℃下低溫處理72h效果較佳；Ashok Kumar等將黃瓜花蕾在4、32℃下分別處理1～10d，結果表明在4℃下處理2d的效果最佳。

3.2 接種密度

接種密度與誘導率成正相關。接種密度不可過大，以盡量減少花藥在空間和營養上的競爭和選擇：但也不能過少，否則不利于促進物質的形成，也不利于愈傷組織的形成。西瓜花藥培養通常在6cm的瓶中接種4個花蕾的20枚花藥。

3.3 培養溫度

花藥培養中，培養溫度對愈傷組織或胚狀體的形成以及促進其生長都有重要作用。大部分葫蘆科作物花藥培養的溫度為25～28℃。溫度過高會導致某些種類花藥的死亡。瓜類的花藥培養溫度比其他種類要高一些，白天溫度一般為25～30℃，夜間則較低。在西瓜花藥培養中，緱艷霞嘗試了將花藥在30℃下高溫預處理72h后置于25℃低溫下，發現也能提高愈傷組織的誘導率。

3.4 培養光照

在一些材料的培養過程中，暗培養可以促進愈傷組織的誘導。但試驗表明，在對甜瓜花藥進行培養時，長時間的黑暗將會使愈傷組織質量有所下降，而適當的光照反而有助于愈傷組織的生長。先黑暗培養后再進行光照培養，也能促進優良愈傷組織的誘導，這在甜瓜、絲瓜上都得到了驗證。在西瓜上還尚未見明確的報道。

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性鑒定技術

染色體計數法是確定倍性最基本和最精確的方法，通常是以根尖為材料，也可選擇以卷須、葉片愈傷組織為材料，可以在組織培養早期檢出倍性。再者，還可以利用掃描細胞光度儀、細胞學和形態學等間接手段進行鑒定。在西瓜子葉離體組織培養中利用西瓜單倍體、二倍體和四倍體對高溫和低溫的不同反應進行倍性鑒定。

5 色體加倍技術

單倍體植株如何加倍成為純合的二倍體植株，對于將花藥培養技術真正用于實際的育種工作至關重要。目前加倍的途徑有2種：自然加倍和人工加倍。在瓜類作物單倍體育種中的單倍體自然加倍率很低，僅在西瓜上有過報道；人工加倍技術一般借鑒傳統的西瓜、甜瓜整體誘導多倍體的方法——秋水仙堿浸泡法來處理單倍體植株，并無多大改進。目前，對于瓜類單倍體加倍的深入研究較少，并且僅局限在單倍體植株的離體加倍處理。Sari和Abak認為，與黃瓜相比，西瓜對秋水仙堿的敏感程度較低。因此通過加倍得到的西瓜雙單倍體植株有正常的葉片、生長勢和育性，自交能獲得種子。

6 存在的問題及展望

雖然西瓜花藥培養技術逐漸完善，但從前人的研究中可以看出，目前花藥培養還存在不少問題。(1)由于藥壁等體細胞的干擾，導致愈傷組織中細胞的倍性變化復雜且沒有成熟的快速鑒定方法。(2)愈傷組織誘導率雖然得到了提高，但分化和再生能力低，小植株的誘導率很低。(3)培養途徑單一，只是通過愈傷組織后再分化、生根。沒有直接形成胚狀體的研究等。

西瓜花藥培養中出現的問題，基本都與生長調節劑種類及濃度相關。尋找合適的生長調節劑種類及濃度是解決西瓜花藥培養的關鍵，并且要注重硝酸銀和三十烷醇的應用。相信在不久的將來，西瓜花藥培養技術能夠逐步完善，為遺傳育種做貢獻。