絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR與SRAP分析

摘要:利用SSR和SRAP標記對30份絲瓜種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，分別從52對SSR和48對SRAP引物中選取10對和12對多態(tài)性好的引物，其中10對SSR引物共擴增出32條多態(tài)性帶，12對SRAP引物擴增出118條多態(tài)性帶。30份種質(zhì)間的平均遺傳相似系數(shù)為0.761，說明絲瓜間種質(zhì)遺傳背景比較狹隘。聚類分析顯示，30份絲瓜種質(zhì)被劃分為普通絲瓜與有棱絲瓜兩大類。

關鍵詞:絲瓜；遺傳多樣性；SSR；SRAP

絲瓜為葫蘆科(Cucurbitaoeae)絲瓜屬(Luffa)一年生攀緣性草本植物，原產(chǎn)于印度或亞洲南部熱帶地區(qū)，以主蔓結瓜為主。染色體為2n=2x=26，在生產(chǎn)上分為普通絲瓜[Luffa cylindrica L)Roem]和有棱絲瓜[L.acutangula(L.) Roxb.]2個栽培種，在我國南北方均有栽培，是我國主要瓜類蔬菜。我國絲瓜育種起步較晚，遺傳育種研究基礎比較薄弱，對各種絲瓜種質(zhì)資源的遺傳背景及親緣關系還不太清楚，而利用生物技術創(chuàng)新育種材料的研究則更少。夏軍輝等應用形態(tài)標記和RAPD標記對26份絲瓜種質(zhì)材料進行了遺傳多樣性和親緣關系的分析；陳朝文對30份絲瓜品種進行ISSR檢測與聚類分析，將30份材料分為普通絲瓜與有棱絲瓜兩大類。本試驗采用SSR和SRAP標記相結合的方法，對國內(nèi)30份絲瓜(其中22份來源于國家種質(zhì)資源庫)種質(zhì)間進行遺傳多樣性和親緣關系的研究。在DNA分子水平上分析其遺傳差異，以進一步豐富絲瓜遺傳多樣性研究，并為絲瓜育種中親本的選擇和選配研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試30份絲瓜材料主要由中國農(nóng)業(yè)大學蔬菜系蔬菜育種實驗室提供，其中22份來源于國家種質(zhì)資源庫，材料編號、品種名稱及來源見表1。

1．2 試驗方法

1．2．1 DNA提取 2009年1月將供試材料播種于中國農(nóng)業(yè)大學試驗站溫室中育苗，待幼苗長出3片真葉時以其為材料，采用CTAB法提取總DNA。利用紫外可見分光光度計和0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，根據(jù)A260值計算DNA濃度，并把DNA提取液稀釋為30ng/μL作為PCR擴增的模板。

1．2．2 SSR-PCR 引物序列本實驗52對SSR引物參照已報道的甜瓜SSR引物序列和中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供黃瓜SSR引物序列，由北京三博遠志有限公司合成。反應體系及參數(shù)：SSR反應體系15μL包括10xbuffer 1.5μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.4μL，dNTP(2.5mmol/L)0.8μL，模板DNA約40ng，Toq酶(2.5U/μL)0.4μL，用ddH₂O補足體積。PCR擴增反應程序為:94℃預變性4min；94℃變性30s.55℃退火30s.72℃延伸60s，共35個循環(huán)；72℃延伸7min。反應結束后加入3μL變性buffer，95℃變性5min后采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)分離擴增產(chǎn)物，銀染法進行檢測，掃描并統(tǒng)計結果。

1．2．3 SRAP-PCR 引物序列參考Ferriol與林忠旭等文獻中引物，共選取正向引物6條和反向引物8條，正反引物兩兩搭配組合，形成48對引物組合。反應體系及參數(shù):SRAP反應體系20μL包括10xbuffer 2μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.8μL，dNTP(2.5mmol/L，each)μL，模板DNA約40 ng，Taq酶(2.5U/μL)0.5μL，用ddH₂O補足體積。PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，擴增5循環(huán)；再將退火溫度升至50℃，擴增35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。反應結束后加入5μL變性buffer，95℃變性5min后采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)分離擴增產(chǎn)物，銀染法進行檢測，掃描并統(tǒng)計結果。

1．2．4 數(shù)據(jù)處理與計算 SSR和SRAP擴增產(chǎn)物分別按條帶有無分別賦值，有帶標記為“1”，無帶標記為“0”，缺失為“9”。用NTSYSpc-2.10軟件進行數(shù)據(jù)分析。對原始矩陣用SimQual程序求DICE相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣。用SHAN程序中的UP-GMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2．1 SSR標記分析

52對黃瓜與甜瓜SSR引物對30份絲瓜材料分析結果表明，共有23對引物擴增出條帶，其中10對引物有比較清晰的多態(tài)性條帶，產(chǎn)生多態(tài)性擴增的引物比率為19.2％，這10對引物共擴增出47條帶．多態(tài)性帶32條，占總帶數(shù)的68.1％，擴增片段大小在120～1500bp(表2)。平均每對引物可擴增出4.7條帶，其中擴增條帶最多的引物為CMAGN73，共9條；擴增條帶最少為CMATN22，僅有2個多態(tài)性位點。

2．2 SRAP標記分析

從48對SRAP引物中挑選出12對在30份絲瓜材料都能產(chǎn)生良好清晰條帶的引物。這12對引物共擴增出189條帶(擴增片段集中在100～2000bp)，其中多態(tài)性帶有118條，占總帶數(shù)的62.4％。平均每對引物可擴增出15.75條帶，可提供9.8個多態(tài)性位點，平均每個引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶比率(PPB)為62.4％。其中ME5/EM3引物對的多態(tài)性比率最高，為87.5％(表3)。

2．3 基于SSR和SRAP標記的聚類分析

使用NTSYS pc-2.10軟件對30份絲瓜材料的SSR與SRAP標記進行聚類分析，用UPGMA法對擴增結果進行遺傳相似系數(shù)計算，通過Tree-plot生成聚類圖(圖1)。30份絲瓜材料之間相似系數(shù)變異范圍在0.297～0.937，平均為0.761。其中20號(金華白皮絲瓜)和21號(白天羅)相似系數(shù)最高，為0.937．可能由于這2份材料同是來自浙江的白皮絲瓜．親緣關系較近；而來自海南的28號(賈美S1絲瓜)與來自西南地區(qū)的3號(黑子線絲瓜)相似系數(shù)最小，這2個品種間形態(tài)差異較大，且2個品種間地域相差較遠也可能是造成相似系數(shù)低的原因。

以遺傳相似系數(shù)0.570的水平上可將30份絲瓜分為2大類，第1類包括6，7，26，28共4份有棱絲瓜種質(zhì)；第2類為其余26份普通絲瓜種質(zhì)。在相似系數(shù)0.780處，可將第2類分為2個亞類：第1亞類包括了蕪湖絲瓜、糯絲瓜、Ii號S1、自留種Sl、江蘇本地絲瓜、上杭長絲瓜、福建越初、早絲瓜共8份種質(zhì)，其共同特征是果面較光滑，無棱或微棱，肉質(zhì)松軟，為中晚熟品種。第2亞類包括了冬瓜絲瓜、黃皮絲瓜、邵陽香絲瓜、阮陵棒頭絲瓜、金華白皮絲瓜、白天羅、1號S1、白絲瓜、胖絲瓜、潛質(zhì)1號S1、長農(nóng)S1、銅仁肉絲瓜、長沙白絲瓜、侯馬絲瓜Ⅱ、黑子線絲瓜、侯馬絲瓜Ⅰ、農(nóng)選1S1、香絲瓜共18份種質(zhì)，其中包括4份白絲瓜種質(zhì)，共同特征是瓜皮乳白色．瓜面較平；其中2份來自山西侯馬的絲瓜品種，其形態(tài)學相似系數(shù)較高，但分子水平上表現(xiàn)出一定的差異；總體來說這組組內(nèi)種質(zhì)間形態(tài)性狀和地域差異較大，無法從形態(tài)上進行很好的區(qū)分。

3 討論與結論

SSR標記具有保守型，同一引物可以移植到同一科的不同植物中，本實驗利用引物通用性原理，利用黃瓜與甜瓜已報道的SSR引物來探索絲瓜可用的SSR引物。所有52對引物能成功擴增出條帶的引物比例為44.2％。有多態(tài)性條帶的引物比例為19.2％。與李楠等利用940對引物對黃瓜、西瓜、甜瓜三套重組自交系群體的作圖親本分析SSR引物在不同瓜類作物間的通用性與多態(tài)性的結果相似。說明不同瓜類作物基因組間存在一定的相似性．但瓜類作物引物通用率較低。

SSR和SRAP標記都具有復性好、多態(tài)性中、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點。是較靈敏的分子標記，能夠提供足夠的遺傳信息，已經(jīng)被應用于多種葫蘆科植物的遺傳多樣性研究。本研究中用10對SSR引物和12對SRAP引物共擴增出150條多態(tài)性帶，能夠有效地將30份絲瓜種質(zhì)分為普通絲瓜與有棱絲瓜兩大類，這與夏軍輝等運用RAPD標記技術對26份絲瓜種質(zhì)分為兩大類，陳朝文利用ISSR標記技術也將絲瓜屬普通栽培種分為普通絲瓜與有棱絲瓜兩大類基本一致，說明了SSR和SRAP標記與RAPD、ISSR所揭示的分類結果相一致。

從SSR和SRAP標記分析獲得的遺傳相似系數(shù)，大部分地方絲瓜品種的相似系數(shù)值都在0.7以上，親緣關系較近。30份絲瓜材料平均相似系數(shù)高達0.761，這與夏軍輝和陳朝文等的研究結果相似，其中金華白皮絲瓜與白天羅的相似系數(shù)值高達0.937，可能是來源于相同的材料經(jīng)相互引種演化而來，接近同物異名。我國絲瓜栽培種的遺傳多樣性僅在種間比較豐富，普通絲瓜與有棱絲瓜遺傳變異較大，但各種內(nèi)遺傳變異較小，遺傳背景也比較狹隘。因此，在絲瓜種植資源的創(chuàng)新及雜交育種中，利用分子標記有目的選擇遺傳距離較大的材料作親本進行選配，不僅會產(chǎn)生較強的雜種優(yōu)勢，也有利于拓寬絲瓜的遺傳基礎。

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