利用單單雜交技術選育出平菇菌種A0713

摘 要：隨著食用菌行業的發展，利用生物技術手段培育出優良平菇新品種逐步成為各國科學家研究的重點，但因平菇品種繁多，名稱不統一，直觀判斷其優劣不夠準確和科學，給深入研究帶來了很多不便。本試驗利用模糊綜合分析法初步研究了17種異源菌種的優劣，而后利用原生質技術中的單單雜交方法對2種異源菌種進行了雜交，經過菌絲鏡檢、A0713與親本拮抗試驗和A0713出菇試驗初步證明融合成功。

關鍵詞：平菇；模糊綜合分析；單核菌絲；單單雜交

平菇是一種廣為人知的食用菌資源，其含有豐富的氨基酸和人體必需的微量元素，越來越受到人們青睞。我國有著豐富的食用菌資源，平菇(Pleu-rotus ostreatus)隸屬于擔子菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、側耳屬。平菇是一種白腐真菌，菌絲體為白色的絲狀體。1朵平菇其中含數億孢子，平菇是四極性異宗結合的品種，是由成熟子實體產生擔孢子在適宜環境下長出芽管，初期多核，芽管不斷分枝伸長，形成單核菌絲。不同性別的單核菌絲結合(質配)后形成雙核菌絲。雙核菌絲主要特征是在隔膜上有鎖狀聯合。在適宜條件下雙核菌絲可以形成子實體。平菇具有生長迅速抗逆性強等優點，因而栽培廣泛，

隨著食用菌行業的不斷發展，食用菌的營養和藥用價值越來越被人們所認知。平菇作為一種常見的食用菌產品也備受人們喜愛，其含有大量人體必需的氨基酸和各種礦物質。為了讓食用菌能夠適應更多樣的環境或者使其含有更豐富的營養，選育新的平菇菌種至關重要。本試驗采用模糊綜合分析法研究異源平菇菌種，以便更加科學地判斷菌種優劣，為改良平菇菌種提供必要的材料和理論依據。

目前食用菌原生質體技術已成為食(藥)用菌生理、生化、遺傳等基礎理論研究和進行菌種改良的一種有效手段，1957年，Eddv等首次用蝸牛酶溶解酵母菌細胞壁，分離到原生質體。這項技術應用到食用菌行業是在1973年，當時Wessds和Devries分離得到了裂褶菌的原生質體。利用原生質體培育新品種的技術主要有：原生質體融合技術、原生質體誘變技術、單核和同核原生質體技術、原生質體的轉化等方法。本試驗是把初篩得出的擁有良好性狀的平菇進行單核融合，然后利用有無鎖狀聯合初步選擇出融合子，通過出菇試驗進行驗證，為平菇菌種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1

對28種平菇拮抗試驗供試菌種：平特大8號、大白平1號、短平、蘇引6號、華平49、華平36、華平97-2、雜交16、雜優6號、白平5號由華中農業大學提供；109、平二號、皚雪、黑平王、四季大白、539、平一號、澳黑、326由哈爾濱食用菌研究所提供；00412、801、802、00329、00410、優光1號、黑平菇22號由中國農業科學院植保研究所提供；平保1、平保2由東北農業大學微生物實驗室提供。培養基：PDA培養基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀1g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL)。

1.1.2 對17種異源側耳模糊綜合評價供試菌種：澳黑、平特大8號、短平、蘇引6號、黑平王、華平36、雜交16、白平5號、109、平二號、皚雪、四季大白、539、326、00412、801、優光1號。培養基：PDA培養基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL)；液體PDA培養基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，蒸餾水1000mL)。

1.1.3 利用單單雜交技術選育平菇供試菌種：選擇綜合指數比較好，而且蛋白和漆酶含量較高的Y₅號和Y₁號菌株。培養基：PDA培養基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂05g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL)，pH值自然；液體再生培養基(MB)：蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇10g，葡萄糖2g，MgS0₄0.5g，蒸餾水100mL，pH值7.0。

上述培養基均在1.21 x10⁵Pa下濕熱滅菌30min。配制0.6mol·L^-1MgS0₄，0.6mol·L^-1甘露醇待用。溶壁酶：廣東微生物研究所研制，用前配制，0.22μm微孔濾膜過濾。

1.2 試驗方法

1.2.1 對28種平菇拮抗試驗 以選定菌株的粗蛋白含量、漆酶活性、日均生長量、干物質質量為變量，采用模糊概率法更科學地評價多個菌種生物特性的綜合規律變化，從而客觀評價菌株優劣。此方法克服了用單一條件評價菌株優劣的局限，王國印將模糊概率應用于棉花品種綜合評價，并取得良好結果。在PDA培養基試管上做拮抗試驗。每2種菌株為1組，把2個不同菌株接到同1試管斜面上，2個接種點間距約4cm，置于28℃恒溫培養箱中培養，當不同菌源菌絲生長邊緣靠近時，自正面觀察其繼續生長情況，自反面觀察色素沉著情況。

1.2.2 對17種異源側耳模糊綜合評價試驗 以選定菌株的粗蛋白含量、漆酶活性、日均生長速度、干物質質量為變量，采用模糊概率法更科學地評價多個菌種生物特性的綜合規律變化，從而客觀評價菌株的優劣。此方法克服了用單一條件評價菌株優劣的局限。將菌種接于固體PDA平板培養基上，以接種點為中心在其萌發后第2天開始測每天的長速：在含玻璃碎片液體PDA培養基里，用接種器接入半徑3mm菌種塊，于黑暗中靜止4d后進行搖床培養，培養條件為25℃，220r.min^-1，培養4d后按10％接種量接人搖瓶培養基中，在溫度25℃、轉速220 r·min^-1的搖床中震蕩培養5d，測干物質質量、漆酶活性和粗蛋白含量。

1.2.3 利用單單雜交技術選育平菇試驗 由于1973年Wessels和Devries在研究裂褶菌原生質體的制備和再生中，發現再生菌絲體中存在雙核、單核2種。后來研究發現菌絲體在制備原生質體時出現3種類型的原生質體，即無核原生質體、單核原生質體和雙核原生質體。所以本試驗采用利用原生質體再生的方法培育出菌絲。然后挑出其中單核菌絲進行雜交，通過雜交后子代與親本拮抗試驗和出菇試驗進一步證明融合是否成功。

1.2.3.1 菌絲培養 在PDA液體菌種內加適量玻璃碎片滅菌后接入直徑約6min菌種。先在黑暗25℃條件下靜止4d，然后置于搖床培養5d，吸取1～2mL菌懸液接到含20mL液體培養基的150mL三角瓶中，在220r·min^-1的搖床上培養6d，溫度25℃。

1.2.3.2 原生質體制備和再生 通過過濾獲取培養好的幼嫩菌絲體200mg，經無菌水清洗2遍和滲透壓穩定劑洗滌2次，再用無菌水洗滌后吸去水分，按照菌絲(1mg)：酶液(8μL)比率加1.5％溶壁酶液，在28℃下水浴6h，在酶解過程中進行振蕩，一般每0.5h左右1次，可使原生質體懸浮。將原生質體懸浮液用滅完菌的脫脂棉柱過濾，把殘余菌絲體過濾除去，然后濾液經2000r·min^-1、4℃離心10min，取沉淀即為所需原生質體。在原生質制備中每個條件都十分關鍵，直接影響到原生質體的釋放量，對于酶液濃度、酶解時間、穩滲劑濃度的合理配比研究也十分重要(另文發表)。將得到的原生質體用滲透壓穩定劑(0.6m01，L^-1甘露醇)懸浮稀釋，涂布于再生培養基上25℃培養，20d左右培養基上可出現微小再生菌落，挑取其菌落于斜面試管中在25℃下培養。

1.2.3.3 單核菌絲體收集從再生培養基挑出的試管菌種中挑出菌絲，加入少量蒸餾水，進行鏡檢，看其是否有鎖狀聯合，沒有鎖狀聯合的即為單核菌絲。

1.2.3.4 單核菌絲的雜交 由于平菇是異宗的雙因子結構，所以將2種異源單核菌株同時接在PDA平板上，接種點相距2cm左右，在25℃下培養，當2種異源菌絲生長到相互接觸時就很可能發生單核體菌絲融合、核遷移、形成異核體的雜交結果，所以當2種異源菌絲生長到一起時，挑取相重疊部位的菌絲體，將其置于另一平板上培養，6d以后在顯微鏡下觀察其結構是否出現鎖狀聯合。而后進行親本與雜交體拮抗試驗，再將其制作成栽培菌種接種于糞與秸稈發酵料中看其是否出菇，從而初步判斷融合是否成功。

2 結果與分析

2.1 對28種平菇的拮抗試驗

將試驗結果與拮抗發生的類型相對比：異源菌絲生長到一起時向上隆起，形成脊。背面形成透光差的環形線，有色素沉著。異源菌絲形成脊；背面具陰影無色素沉著。異源菌絲停止生長。在培養基表面形成帶狀隔離區。反面清澈。異源菌絲相接處的氣生菌絲頂端扭曲呈球狀變形，無色素沉著。由于處于不同類群菌株間是明顯存在拮抗的，所以筆者通過這幾種典型的現象初步篩選出17種異源平菇菌株。

2.2 對17種異源側耳的模糊綜合評價

設定17個待測菌種：(1)澳黑，(2)平特大8號，(3)短平，(4)蘇引6號，(5)黑平王，(6)華平36，(7)雜交16，(8)白平5號，(9)109，(10)平二號，(11)皚雪，(12)四季大白，(13)539，(14)326，(15)00412，(16)801，(17)優光1號，依次為Y₁……Y₁₇。設干物質質量為X₁，蛋白含量為X₂，漆酶活性X₃，日均生長量X₄，長勢為X₅。見表1。

式中X_{表示第i菌株的第j性狀值，MaxXi、MinXi分別表示該性狀值中的最大值和最小值。U則表示第i菌株第j性狀對MaxXi的隸屬度。}

根據經驗，反映側耳菌株優劣的某一性狀的權重是恒定的，并可由主觀經驗確定X₁，權重W₁。是0.25，X₂權重W₂是0.25，X₃權重W₃是0.2，X₄，權重W₄是0.15，x₅權重W₅是0.15。即權重集W=|W₁，W₂，W3，W₄，W₅}|。見表2。P(W^j)=∑^m_i=IW(U^y)ⁱWⁱ

式中P(W_j)是菌株的模糊概率，W_i是權重。

表3顯示，Y₅號菌株最優，Y₁₅號菌株最差，但利用模糊綜合分析法對菌種做出的優劣評價并不能直接反映菌種在生產上的優劣，僅供參考。

2.3 利用單單雜交技術選育平菇

2.3.1 原生質體釋放和單核菌絲分離 通過原生質體制備得到平菇的原生質體。在28℃、酶解3h、酶濃度為1.5％溶壁酶時可以得到原生質體的最大釋放量，為3.4x107個／mL，效果不錯。圖1為平菇5號原生質體釋放照片。通過對單核菌絲的挑取和培養得到了平菇Y₅號和平菇Y₁號的單核菌絲體，見圖2、3。

2.3.2 單核體雜交 對所挑出的所有樣品進行分析，發現第8天挑出的菌絲體經過培養后有鎖狀聯合結構產生(圖4)。在與親本進行的拮抗試驗中可以看出，雜交體A7(下端)與2個親本(上面左右2個分別為Y₅號和Y₁號)都有拮抗現象(圖5)。在出菇試驗中，接種20d后，雜交后的新品種A0713在料表面扭曲成結，形成菇蕾，在接入料29d雜交后的新品種成功地在雞糞占9％的雞糞秸稈發酵料中出菇(圖6)，初步表明雜交成功。

3 討論

本試驗對菌株的初篩采用的是拮抗方法，雖然可以方便的選出異源菌株，但有極少數異源菌株互相沒有拮抗效應，應用分子鑒定方法才是證明異源性的關鍵。本試驗全面客觀地分析了所搜集的平菇菌種，相比原來采用單一或直觀判斷菌種優劣的方法有了明顯優勢。但是此評價只是在實驗室分析的基礎上結合統計分析方法做出的判斷，其生產效果還有待觀察。

本試驗對原生質體釋放和再生條件的摸索還有欠缺，用的酶處理時間為3h，比一般得出的結果稍長些。利用單單雜交方式進行了新菌株的培育，并且初步取得了成功。單單雜交技術是一種原生質技術，其操作簡單。實用性強，發展前景廣闊。根據是否含有鎖狀聯合、親本和雜交體的拮抗性，出菇試驗只是初步判斷融合子的方法，雜交得到新菌株的物化特性也有待探索。

4 結論

本試驗通過拮抗的方法初篩了28種平菇菌種，從而得到17株異源菌株。通過模糊綜合分析法對所選的17種平菇菌株，通過干物質質量、蛋白含量、菌絲日均生長量、漆酶活性和長勢幾個因素進行綜合評價，得出菌種的優劣次序，其中得到的₅號菌株為最優，Y₁₅號菌株為最差。利用原生質技術中的單核菌絲雜交技術培育出A0713菌株，并且通過對A0713的鏡檢、A0713和親本的拮抗試驗、A0713的出菇試驗初步證明融合成功。