骨髓間充質干細胞在糖尿病模型創面中向表皮細胞分化的初步研究

[摘要]目的:探討糖尿病皮膚創面微環境中的骨髓間充質干細胞分化為表皮細胞的可能性。方法:從大鼠骨髓中分離純化骨髓間充質干細胞。選取第3～4代細胞，應用5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)標記技術進行細胞標記;同時采用一次性腹腔內注射鏈脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型。2周后，在大鼠背部人工造成圓形創面，將已標記的骨髓間充質干細胞以注射方式回植入糖尿病大鼠創面組織周圍，分別于注射后2、3周取材，常規石蠟包埋、連續切片，行BrdU和角蛋白免疫組織化學染色。結果:BrdU陽性細胞出現在表皮、真皮及皮下組織各層，連續切片表皮層中部分陽性細胞同時也表達角蛋白。結論:在糖尿病潰瘍愈合過程中，骨髓間充質干細胞具有向表皮細胞分化的潛能。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞;糖尿病;創面愈合;表皮細胞;細胞分化

[中圖分類號]Q813.11Q254[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)01-0065-03

Preliminary study on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into epidermal cells in diabetic wound

ZHONG Xiao-hong，WANG Ming-gang，ZHAO Li-ping，GAO Xin-yu

(Department of Plastic Surgery，the Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001，Anhui，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into epidermal cells under the microenvironment of diabetic wound.Methods MSCs were isolated from the myeloid tissue of the rats， purified and cultured. Third-or fourth-generation MSCs were selected and labelled with 5-bromodeoxyuridine (5-BrdU). The rats were injected intraperitoneally with streptozocin(STZ) once to establish diabetes rat model. After 2 weeks， a round skin was excised on all dorsal back of rats. BrdU-labelled MSCs were， by means of injection， engrafted to skin of the rats. The specimens were harvested from the wound tissues for paraffin embedding and serial section at the 2nd and 3rd week after transplantation and were immunohistochemically stained by either BrdU or keratin. Results BrdU positive cells aggregated in the epidermis， dermis and hypodermia. In serial section， some positive cells expressed keratin simultaneously in the epidermis. Conclusion During the course of the diabetic wound healing， MSCs have the potential for differentiating into epidermal cells.

Key words: marrow mesenchymal stem cells; diabetes mellitus; wound repair; epidermal cells; cell differentiation

創面愈合是一個由細胞、細胞外基質及細胞因子等多因素共同參與并高度協調、相互調控的復雜的生物學過程，其中任何一個環節協調不良或功能障礙均可導致創面長期難以愈合;而慢性難愈合創面發生機制更加復雜，至今尚未完全闡明。在臨床實踐中，糖尿病潰瘍的治療是慢性創面愈合中最為棘手的問題。近年來，隨著組織工程學研究的不斷深入，干細胞受到前所未有的重視，特別是來源于骨髓的間充質干細胞;由于其具有向各種組織細胞分化的巨大潛能[1]，且免疫原性小，所以骨髓間充質干細胞的應用為糖尿病潰瘍的愈合提供可能。本實驗以大鼠為研究對象，將骨髓間充質干細胞植入糖尿病大鼠創面組織周圍，觀察其向皮膚表皮細胞分化的潛能。

1材料和方法

1.1 實驗動物:健康SD雄性大鼠8只，年齡4～6周，體質量為134～161g。購自安徽醫科大學附屬省立醫院實驗動物中心。1.2 主要試劑和儀器:胎牛血清(FCS)(Hyclone公司);L-DMEM培養基(Hyclone公司);胰蛋白酶(Sigma公司);5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)(Sigma公司);兔抗Brdu單克隆抗體及SP系列免疫組化染色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司);小鼠抗廣譜細胞角蛋白單克隆抗體及即用型SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(北京中杉生物技術有限公司);BB16型CO2恒溫、恒濕培養箱及HF-safe-1200型超凈工作臺(德國Heraeus and LISHEN公司);CKX41型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);血糖儀和血糖試紙(歐姆龍公司)。

1.3 骨髓間充質干細胞的分離培養、純化和擴增:將大鼠腹腔麻醉后引頸處死，75%酒精浸泡10min;無菌條件下取出股骨和脛骨，并用紗布將骨表面肌肉磨凈，離體的骨放入培養皿中，用高壓滅菌過的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再移入另一培養皿中，加入3ml培養液;將骨的兩端剪斷，暴露骨髓腔，lml注射器抽取培養液注入股骨和脛骨，小心沖出骨髓，反復沖洗4～6次，直至腔內所有骨髓血沖凈;將含骨髓細胞的培養液移入15ml離心管中，1 500r/min離心5min;棄上清，加入2ml含10%FCS的L-DMEM培養液，充分吹散細胞后按1×106/ml密度接種于細胞培養皿內，再加入8ml含10%FCS的L-DMEM培養液(含100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養箱中培養，24h后更換培養液，棄去未貼壁的細胞，每隔2～3天換液，待長滿80%左右按1:2比例傳代，取培養較純的第3～4代細胞備用。

1.4 骨髓間充質干細胞的5-BrdU標記:選用第3～4代細胞，細胞移植前48h，以含終濃度為10μmol/L的5-BrdU進行標記;2天后，0.25%胰酶室溫下消化、1 500r/min離心5min，PBS洗滌、收集細胞。

1.5 動物模型的建立和骨髓間充質干細胞的輸注:取SD雄性大鼠6只，適應性喂養2周后，禁食12h，按65mg/kg體質量劑量一次性腹腔內注射鏈脲佐菌素(溶于0.1mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.4);48h后，連續三次裁尾取血，用歐姆龍血糖試紙測試大鼠的血糖值均≥16.7mmol/L，糖尿病大鼠模型誘導成功;同時用0.3%戊巴比妥鈉按10ml/kg體質量劑量作大鼠腹腔注射麻醉[2];待麻醉成功后，在大鼠背部制作半徑為0.8cm的圓形創面，取密度為1.0×106/ml 5-BrdU標記的骨髓間充質干細胞1ml，均勻注射于大鼠創面邊緣;分別于注射后2、3周切取創面中央再生組織塊，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，2μm連續切片，備用。

1.6 免疫組織化學染色:連續切片采用SP法進行免疫組織化學染色，嚴格按照美國ZYMED公司提供的免疫組織化學試劑盒說明書操作，DAB顯色劑顯色。兔抗Brdu單克隆抗體工作濃度1:100;小鼠抗廣譜細胞角蛋白單克隆抗體工作濃度1:50。以非特異血清代替一抗作為陰性對照，以細胞核呈深棕色著色為BrdU陽性細胞，角蛋白陽性細胞胞漿呈棕黃色。

2結果

2.1骨髓間充質干細胞純化和擴增:細胞接種24h后，換液棄去未貼壁細胞，貼壁的骨髓間充質干細胞大多呈圓形或不規則形，散在生長，分布不均，含有較多雜質細胞。約5～6天后，骨髓間充質干細胞開始成集落樣生長。隨著細胞密度的增加，胞體變得細長，雜質細胞隨著多次換液漸漸減少。約10～12天時，細胞已基本長滿皿底，見圖1A。原代培養12～14天時，雜質細胞隨著換液全部清除，貼壁細胞形態比較一致;經胰酶消化后1∶2傳代，傳代后每2～3天換液1次，約7天長滿皿底。連續傳至第3～4代后，骨髓間充質干細胞形態上更加趨于一致，為成纖維細胞樣細胞，呈漩渦狀、輻射狀或網狀排列，生長旺盛，見圖1B。

2.2HE染色:新生表皮較厚，細胞層數較多且分層明顯，基底細胞呈單層柱狀排列，結合緊密，組織結構完整，較多的皮膚附屬器分布于真皮層中，見圖2。

2.3免疫組織化學染色:第2、3周創面組織切片中，表皮、真皮及皮下組織中均可見到BrdU陽性細胞，細胞核呈深棕色;連續切片表皮層中部分BrdU陽性細胞同時也表達角蛋白，細胞胞漿呈棕黃色，見圖3A、B。這就說明了部分細胞可能為植入帶有5-BrdU標記的骨髓間充質干細胞轉化而來的表皮細胞。

3討論

體表慢性難愈性創面的治療一直是臨床上倍受關注的問題，由于其發病機制復雜、病程長，已成為外科領域的一大難題，尤以糖尿病潰瘍的治療最為棘手。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高和逐步進入老齡化社會，糖尿病的發病率呈現明顯的升高趨勢，糖尿病潰瘍作為糖尿病的常見并發癥，具有難治愈、易感染和高截肢率的特點;這不僅給患者帶來極大的痛苦，也給社會增加了沉重的負擔。因此，如何促進糖尿病潰瘍愈合已經成為急需解決的問題。

骨髓間充質干細胞是骨髓中非造血干細胞的另一類重要干細胞，來源于中胚層，有很強的自我復制和多向分化的潛能，可以產生具有各種表型的子代細胞，分布于全身的結締組織中[3]。由于骨髓間充質干細胞是未分化的前體干細胞，表型分化尚不成熟，免疫原性小，所以同種異體移植骨髓間充質干細胞后無排斥反應或反應較弱，能夠作為組織工程中多種種子細胞。國外許多研究結果證實，骨髓間充質干細胞可以分化為多種不同類型的細胞，包括成纖維細胞、骨和軟骨、肌肉(骨骼肌和平滑肌)和神經細胞等[4-11];有文獻顯示骨髓間充質干細胞對受損創面有明顯促愈作用[12]，這可能與骨髓間充質干細胞能夠釋放許多促進創面愈合的生長因子和細胞因子有關[13-17];Badiavas等[18]已成功證明在急性皮膚創面微環境下骨髓間充質干細胞具有分化為表皮細胞的潛能;這也為其在慢性創面中向表皮細胞分化提供一種設想依據。

細胞角蛋白是表皮或上皮組織較特異表達的一類蛋白，通常情況下，骨髓間充質干細胞角蛋白呈陰性表達。本實驗應用5-BrdU標記的異體骨髓間充質干細胞輸注入糖尿病大鼠創面組織周圍，免疫組織化學染色檢測表皮層中已標記的細胞是否表達角蛋白，從而推測骨髓間充質干細胞在糖尿病創面中是否具有向表皮細胞分化的潛能。糖尿病大鼠模型的制作是采用一次性向大鼠腹腔內注射鏈脲佐菌素，注射48h后，連續三次檢測大鼠血糖值均明顯高于正常值，符合糖尿病模型的診斷標準。免疫組織化學染色結果顯示新生表皮層中含有較多的BrdU染色陽性細胞，而且部分陽性細胞同時表達角蛋白;最終的實驗結果提示:在糖尿病潰瘍愈合過程中，骨髓間充質干細胞具有向表皮細胞分化的潛能。

目前，骨髓間充質干細胞分化為多種類型細胞的分子機制和分化能力尚未完全闡明，這可能是限制其應用研究的主要因素。國外研究結果證實了干細胞是存在于高度受調控的被稱為“壁龕”的微環境中[19-20];但壁龕的組織成分相當復雜，各種不同的組織細胞所處的微環境不同，其中最主要的就是各種因子的不同;而且多數學者也一致認為，骨髓間充質干細胞分化為何種細胞也與其所處的微環境密切相關，這是骨髓間充質干細胞向其他組織細胞分化的主要原因之一。因此，處于受損皮膚的微環境下，骨髓間充質干細胞可能具有向皮膚組織細胞轉化的潛能。本實驗采用人工制作糖尿病潰瘍微環境來誘導骨髓間充質干細胞在慢性創面中向表皮細胞轉化，實驗結果證實了該細胞具有分化為表皮細胞的能力，促進了糖尿病創面的愈合;但是，慢性創面微環境中的骨髓間充質干細胞轉化為皮膚組織細胞的分化機制與分化能力是否和在急性創面微環境中有所不同，以及轉化的表皮細胞是否具有正常的生理功能等這些問題尚沒有相關文獻報道;新生的真皮層中分布較多的皮膚附屬器，是由骨髓間充質干細胞分化而來還是愈合中自身形成的，還需要進一步研究證實。

總之，在糖尿病潰瘍愈合過程中，骨髓間充質干細胞分化為表皮細胞已得到初步證實，可以作為治療該病的一種種子細胞，為今后臨床上治療糖尿病創面提供一種有效的手段。

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[收稿日期]2009-11-02 [修回日期]2010-01-05

編輯/張惠娟