臍橙根際拮抗細(xì)菌的篩選與初步鑒定

摘 要:對臍橙根際土壤細(xì)菌進行分離，得到116個土壤分離物。通過對峙試驗篩選，共選出16個細(xì)菌分離物對炭疽病病原菌有良好的拮抗效果，并對其進行了初步鑒定。根據(jù)分離物的理化性質(zhì)并結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，將QC38、QC61、QC63、QC68四株菌初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus);將QC8、QC79、QC83三株菌初步鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter);將QC13、QC14、QC30、QC35、QC47、QC87、QC123、QC124、QC129九株菌初步鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas)。

關(guān)鍵詞:臍橙; 炭疽病; 拮抗; 對峙試驗

中圖分類號:S154.38+1 文獻標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2010)03-0064-04

臍橙是一種重要的經(jīng)濟作物，而其炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)[1]發(fā)生日趨嚴(yán)重，發(fā)病嚴(yán)重時引起大量落葉，枝梢枯死，僵果和枯蒂落果，枝干開裂，導(dǎo)致樹勢衰退，產(chǎn)量下降，甚至整枝整株枯死[2]，不但降低品質(zhì)，而且影響其經(jīng)濟價值。化學(xué)防治雖防效可觀，但對環(huán)境的污染、潛在的安全性以及病原物抗性的產(chǎn)生都不容忽視[3]。在環(huán)保、安全、持續(xù)成為發(fā)展方向的今天，生物防治是進行植病防治的首選措施之一，前人的成功經(jīng)驗也說明，從自然界中分離、篩選拮抗菌防治臍橙炭疽病病害是完全可行的[4，5]。本試驗從臍橙炭疽病病區(qū)采集的臍橙根際土壤中分離細(xì)菌，通過對峙試驗篩選出對炭疽病病原菌具有良好拮抗效果的細(xì)菌，并對其進行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 臍橙根際樣品

臍橙根際土壤，采自福建臍橙種植區(qū)。

1.2 菌株

炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)，由本實驗室保存。

1.3 主要培養(yǎng)基

(1) PDA培養(yǎng)基:培養(yǎng)炭疽病病原菌和進行拮抗試驗。

(2) LB培養(yǎng)基:分離根際細(xì)菌，保存與活化菌種。

1.4 臍橙根際細(xì)菌的分離

稱取1 g臍橙根際土壤，放入盛有100 ml無菌水和數(shù)粒玻璃珠的三角瓶中，振搖20 min ，使之充分混勻。取1 ml上述懸浮液加入盛有9 ml無菌水的試管中，制備10-1濃度的懸浮液，同樣方法依次制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的懸浮液。用微量移液器依次分別吸取不同濃度懸浮液 0.1 ml加入至LB固體培養(yǎng)基平板上，均勻涂布，37℃培養(yǎng) 24 h，將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別用滅菌牙簽挑取少許細(xì)胞接種到LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng) [6，7] 。待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物，若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

1.5 拮抗菌的篩選將炭疽病病原菌用接種鏟接種于PDA平板的中央位置，于28℃恒溫培養(yǎng)2 d，待其長成直徑約為2 cm的菌落后，再將活化好的土壤分離物分別通過劃線接種法接種到培養(yǎng)基上，距離病原菌菌落約2 cm(見圖1)，每個培養(yǎng)基接種3個細(xì)菌分離物，l d后檢查對峙培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)病原菌與土壤分離物菌落擴展的速度、菌落之間有無抑制帶、菌落邊緣是否出現(xiàn)稀疏和萎縮現(xiàn)象等來判斷該土壤分離物對病原菌有無拮抗作用。其中，兩菌落之間有明顯的抑制帶即認(rèn)為該分離物對炭疽病病原菌的生長與繁殖具有明顯抑制作用[8]。多次重復(fù)對峙試驗，驗證其拮抗效果的穩(wěn)定性，將具有穩(wěn)定拮抗效果的分離物于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 分離物鑒定

1.6.1 形態(tài)學(xué)特征 對拮抗效果良好的細(xì)菌劃線接種于LB培養(yǎng)基上，待長出菌落后對其菌落特征進行觀察并記錄。

1.6.2 生理生化特性 對所篩選出的拮抗菌進行生理生化鑒定:過氧化氫酶試驗(接觸酶)，明膠液化試驗，淀粉水解試驗，檸檬酸鹽利用試驗，葡萄糖氧化發(fā)酵試驗，甲基紅(MR)試驗，V-P試驗，硝酸鹽還原試`驗，吲哚產(chǎn)生試驗，產(chǎn)H2S試驗，脲酶試驗，脂酶(Tween80)試驗，牛奶分解試驗等參照文獻[6，9]的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 臍橙炭疽病拮抗細(xì)菌的篩選

利用稀釋平板法分離得到116個土壤分離物，經(jīng)過對峙試驗篩選， 16個菌株表現(xiàn)有良好的拮抗效果，分別是 QC8、QC13、QC14、QC30、QC35、QC38、QC47、QC61、QC63、QC68、QC79、QC83、QC87、QC123、QC124和QC129，其部分菌株的拮抗效果如圖1所示。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

革蘭氏染色結(jié)果表明，QC38、QC61、QC63、QC68為革蘭氏陽性菌，其它12株菌皆為革蘭氏陰性菌，16株拮抗菌單菌落形態(tài)描述見表1。

2.3 生理生化特性

根據(jù)菌株的生理生化鑒定結(jié)果(表2、表3)并結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]，可以將QC38、QC61、QC63、QC68四株菌初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，將QC8、QC79、QC83三株菌初步鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter);將QC13、QC14、QC30、QC35、QC47、QC87、QC123、QC124、QC129九株菌初步鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas)。

3 討論

中國是一個農(nóng)業(yè)大國，每年病蟲害發(fā)生面積(2.0～2.6)×108 hm2，農(nóng)藥用量達10×104 t。目前我國的農(nóng)藥結(jié)構(gòu)極不合理，基本上以化學(xué)農(nóng)藥占主導(dǎo)。其中，高毒、高殘留、對環(huán)境影響大的農(nóng)藥用量占半數(shù)以上，開發(fā)新型生物農(nóng)藥是減少化學(xué)農(nóng)藥用量的有效途徑之一，也符合發(fā)展綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求。炭疽病是農(nóng)作物的主要病害之一，如何高效、安全、可靠的進行炭疽病的防治是長期以來亟待解決的難題[10]。我國炭疽病防治研究已經(jīng)取得了很大的進展，不論農(nóng)業(yè)防治、生物防治還是化學(xué)防治都取得了很好的成績，從罹病植株根際土壤或罹病植株本身獲得具有高效拮抗能力的菌株成為炭疽病拮抗菌篩選研究的主要方向。

本試驗通過對臍橙根際土壤細(xì)菌進行分離、篩選與鑒定，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]，將QC38、QC61、QC63、QC68四株菌初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus);將QC8、QC79、QC83三株初步鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter);將QC13、QC14、QC30、QC35、QC47、QC87、QC123、QC124、QC129九株菌初步鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas)。分離菌株與模式菌株在部分生理生化反應(yīng)中存在一定差異，例如QC8的淀粉水解、檸檬酸鹽、脲酶、乳糖發(fā)酵等試驗的結(jié)果與模式菌株Xanthobacter不同，可能是菌株之間的差異。確切地鑒定結(jié)果需要結(jié)合菌株的16S rDNA序列分析或DNA序列同源性分析等得出結(jié)論。

參 考 文 獻:

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