青蛤多糖提取的條件優化及其抗腫瘤活性研究

【摘要】目的:通過考察加水量及加酸量對青蛤多糖提取率的影響，確定青蛤多糖提取的最佳工藝，并研究該多糖的抗腫瘤活性。方法:青蛤肉經蒸餾水浸泡后，酸水解法進行處理;苯酚硫酸法測糖含量。通過冷凍干燥得到青蛤多糖干品，采用MTT法考察青蛤多糖對前列腺癌細胞DU-145的增殖抑制影響。結果:每20g青蛤勻漿液，當加水量為100mL，4mol/L鹽酸的加入量為120mL時，多糖的提取率最高，每100g勻漿液可提取1.8232g多糖。該糖對前列腺癌細胞具有顯著的增殖抑制作用，半數抑制率為4.58mg/mL。結論:采用本方法對青蛤多糖的提取及含量測定操作簡易，重現性較好，所提取的青蛤多糖具有抗腫瘤活性。

【關鍵詞】青蛤;多糖;提取工藝;抗腫瘤活性

【中圖分類號】R917【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)10-028-2

青蛤(Cyclina sinensis)，俗稱黑蛤、鐵蛤、圓蛤、蛤蜊、牛眼蛤，分類學上隸屬軟體動物門、瓣鰓綱、簾蛤目、簾蛤科、青蛤屬，廣泛分布于遼寧、河北、山東、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西以及海南島等地[1]。青蛤蛋白質含量高，脂肪含量較低，而不飽和脂肪酸含量相對較高，并含有多種維生素及微量元素，具有很高的營養及藥用價值[2]。中醫認為，青蛤具有清熱燥濕、軟堅散結和鎮咳作用[3]。現代研究表明，青蛤殼具有治療慢性氣管炎、淋巴結結核、胃潰瘍等多種功能;青蛤肉提取物可以體外抑制人肝癌細胞增殖，增強老齡鼠脾臟內巨噬細胞、淋巴細胞和淋巴結內巨噬細胞的活性，促進免疫細胞應答反應和提高機體免疫力等作用[4]。雖然目前從海洋生物中提取多糖并測定其抗腫瘤活性的文獻已有大量報道[5-10]，但是有關青蛤活性多糖的抗腫瘤活性研究至今還屬空白。本研究采用酸解方法從青蛤組織中提取多糖，考察了料液比和加酸量對多糖提取率的影響，確定從青蛤中提取多糖的最佳條件，并測定該多糖體外對人腫瘤細胞的增殖抑制活性。

1材料

1.1動物與試劑

青蛤購自舟山市場(經浙江海洋學院趙盛龍教授鑒定)，去殼后，-20℃冷藏備用;胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司;胰蛋白酶、F12粉末培養基和MTT均購自美國SIGMA公司;二甲基亞砜購自美國AMRESCO公司。其余試劑均為分析純。

1.2主要儀器

BSA124S型電子天平(德國，Sartorius AG公司);DS-1型高速組織搗碎機(上海標本模型廠);CF16RXII高速冷凍離心機(日立 HITACHI公司);SSW型微電腦電熱恒溫槽(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);722S可見分光光度計(上海恒平科學儀器有限公司);ZHJH-C1209C型超凈工作臺(上海智誠分析儀器制造有限公司);Forma 3111型CO2培養箱(美國Thermo公司);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

2方法

2.1青蛤多糖提取工藝的優化

2.1.1加水量考察

青蛤肉用組織搗碎機搗碎，勻漿。分取20g三份，加入100mL，200mL，300mL蒸餾水，4℃浸泡24h，紗布過濾，5000r/min離心10min，取上清液，用透析袋將其濃縮定容至20 mL，硫酸-苯酚法測定其糖含量。

2.1.2酸解條件考察

取青蛤肉20g三份，分別加入蒸餾水100mL，浸泡24h，紗布過濾，5000r/min離心10min，取上清液。透析袋濃縮定容至20mL，加入4mol/L鹽酸100mL，120mL，140mL，100℃酸解2h，冷卻后用10mol/L氫氧化鈉調pH約6.8，定容至250mL，5000r/min離心10min，取上清液，硫酸-苯酚法測定其糖含量。

2.2硫酸-苯酚法

精密吸取0.1mL待測溶液，定容至20mL，吸取0.1mL置于具塞試管中，依次加蒸餾水至1mL，另設空白試管加蒸餾水1mL，各加5%苯酚溶液1mL，小心振搖混勻，加入濃硫酸5mL，迅速振搖混勻，于室溫下放置30min，在490nm波長處分別測定吸光度，根據標準曲線計算糖含量。

2.3標準曲線繪制

精密吸取1.00mg/mL葡萄糖標準溶液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL置于10ml具塞試管中，依次加蒸餾水至1mL，另設空白試管加蒸餾水1mL，各加5%苯酚溶液1.00mL，小心振搖混勻，加入濃硫酸5mL，迅速振搖混勻，于室溫下放置30min，在490nm波長處分別測定吸光度。

2.4重復性實驗

取青蛤肉20g三份，分別加入蒸餾水100mL，浸泡24h，紗布過濾，5000r離心10min，取上清液。透析袋濃縮定容至20mL，加入4mol/L鹽酸120mL，100℃酸解2h后，冷卻用10mol/L氫氧化鈉調pH約6.8，定容至250mL，5000r離心10min，取上清液，測定多糖含量和RSD。

2.5細胞培養

選取人前列腺癌細胞DU145(原購自中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存)，用含10%小牛血清的RPMI1640完全培養基于37℃，5% CO2培養箱中培養至對數生長期。

2.6細胞增殖抑制率的測定

采用MTT法進行檢測[11]。配制PBS溶液(PH值為7.2)和濃度分別為1.5mg/mL，2.5mg/mL，3.5ml/mL，4.5mg/mL，5.5mg/mL，6.5mg/mL的青蛤多糖溶液。取對數生長期的細胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，于5% CO2，37 ℃貼壁4h，然后分別加入不同濃度的青蛤多糖溶液，每個濃度設3個平行孔，同時設不加藥對照組，置5% CO2，37 ℃培養箱中孵育48h，培養結束加MTT繼續培養4h，吸棄MTT，置酶聯免疫檢測儀在490nm測吸光度，計算細胞增殖抑制指數(IR)，按下列公式計算。

IR=[(對照組A值-藥物組A值)/對照組A值]×100%

2.7數據處理

各組實驗數據測定均做3個平行實驗，結果取其平均值。各組數據之間采用單因素方差分析，用t檢驗進行組間均數的比較，使用SPSS 13.0進行數據分析。

3結果與分析

3.1最佳工藝

3.1.1加水量

當加水量為100mL、200mL和300mL時，所測定的吸光值為0.5514、0.3167和0.2623，由標準曲線可得相對應的糖含量分別為7.2192mg/L、4.1854mg/L和2.5956mg/L(圖1，表1)，各組數據間差異性顯著(P<0.05)，其中當加水量為100mL，即料液比為1:5時，糖提取率最高，每100g青蛤組織可得0.1534 g多糖。

圖1 硫酸苯酚法標準曲線

表1 青蛤多糖提取條件優化結果(I)

Test No.ratio of material to liquidabsorbance value (490nm)sugar content (mg/L)

11:50.55147.2192

21:100.36174.1854

31:150.26232.5956

表2 青蛤多糖提取條件優化結果(II)

Test No.content of acid of 4mol/l(ml)absorbance value (490nm)sugar content (mg/L)

11000.32323.5696

21200.57977.6718

31400.48016.0789

3.1.2酸解條件

當加入鹽酸的量為100mL、120mL和140mL時，酸解后所測得的吸光值為0.3232、0.5797和0.4801，由標準曲線可得相對應的糖含量分別是3.5696 mg/L、7.6718mg/L和6.0789mg/L(圖1，表2)，各組數據差異性均顯著(P<0.05)，且當加酸量為120mL時，糖的提取率最高，每100g青蛤組織可得1.8048g多糖。

3.2重復性實驗

3次平行測定，青蛤多糖的平均含量為每100g青蛤組織可得1.8232g多糖，RSD為0.407%(n=3)，表明重現性良好。

3.3青蛤多糖對DU145細胞增殖的作用

不同濃度青蛤多糖作用于前列腺癌細胞48h后，癌細胞出現明顯的增殖抑制現象，且隨著濃度的增加抑制率逐漸增大，當濃度為6.5mg/mL時，抑制率達到67.90%(表3)。

表3 青蛤多糖對前列腺癌細胞的增殖抑制率

Groupcontent(mg/ml)OD (x±s)Inhibit rate(%)

control0.00.471±0.045*—

11.50.369±0.022*21.26

22.50.327±0.017*30.57

33.50.289±0.007*38.51

44.50.244±0.009*48.21

55.50.187±0.004*60.23

66.50.151±0.011*67.90

* P<0.05vs control group

4討論

由于青蛤肉中含有大量的蛋白質、脂肪等成分，對實驗結果產生干擾，因此需進行除蛋白等處理。對動物多糖除蛋白、脫脂等去除雜質的方法有酶降解法、堿處理法、酸降解法等[12-14]，而多糖含量的測定通常采用滴定分析法、苯酚一硫酸顯色法、蒽酮顯色法等方法，其中以苯酚一硫酸顯色法較為可靠，現被作為測定多糖的首選方法[15]。本研究采用水提和酸解相結合的方法，通過單因素實驗確定了青蛤多糖提取的最佳工藝。當料液比為1:5，經鹽酸除雜后，糖的提取率最高，經重復性試驗再現性很好。在最佳工藝條件下提取的多糖經體外抗腫瘤實驗表明，該糖具有顯著的抗腫瘤活性，對腫瘤細胞的半數抑制率約為4.6mg/mL，且多糖濃度與增長抑制率呈量效關系。

參考文獻

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