α-地中海貧血實驗室診斷技術進展

【摘要】地中海貧血(thalassaemias)，是由于某類珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性貧血，但并不涉及血紅蛋白結構的異常。是人類最常見的單基因遺傳病?？偨Y近年α-地中海貧血實驗室診斷技術，為提高地中海貧血診斷的準確性，減少誤診和漏診，需要要已有的實驗技術綜合應用，開陳出新，盡力創造最為適合患者診斷的實驗手段。

【關鍵詞】α-地中海貧血;實驗室診斷;篩查法;基因診斷

【中圖分類號】R446【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)10-030-2

地中海貧血(thalassaemias)，是由于某類珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性貧血，但并不涉及血紅蛋白結構的異常。是人類最常見的單基因遺傳病。地中海貧血共有α、β、γ、δ等幾種亞類。其中α-地中海貧血最為常見。α-地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血[1]。α-地中海貧血臨床表現與α-珠蛋白鏈的合成減少的程度相關，輕癥者可無臨床癥狀或僅有輕微的血液學改變，中間型者為HbH病，有輕至中度貧血，肝脾腫大，黃疸等，重癥者為血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征，胎兒常于妊娠晚期(30-40周)死亡或早產后數小時死亡。α-地中海貧血主要見于東南亞和地中海地區，美國黑人，印度次大陸亦相當常見。在我國則以南方地區多見，如廣西、廣東、四川、云南等地。因α-地中海貧血的高發病率及重癥者新生兒死亡，故適當的針對α-地中海貧血的診斷具有重大的現實意義，本文就α-地中海貧血的實驗室診斷技術綜述如下:

目前實驗室診斷技術主要有篩查法和基因診斷法兩種[2]:

1篩查法篩查法師實驗室診斷α-地中海貧血的基本方法，具有實驗方法簡便，造價低廉等特點。常見的篩查法包括:血常規測定和血紅蛋白分析。

1.1血常規測定:血液常規檢測(blood routine test)又稱血液一般檢測，包括紅細胞，白細胞及血小板參數檢測。是地中海貧血檢測的第一步，地中海貧血的重要特征之一是小紅細胞和低色素，因此重要的血液學指標是紅細胞平均體積(MCV)及紅細胞平均血紅蛋白(MCH)?，F今臨床診斷中應用的地貧診斷MCV截斷值為國際地貧協會推薦使用的地貧篩查診斷截斷值，為MCV<79fl和MCH<27pg[3]。

1.2紅細胞形態學檢查。在良好的染色血涂片上，正常紅細胞的大小形態較為一致，染色淡紅色，中央著色較邊緣淺。地中海貧血可在血涂片上見紅細胞大小不均，異常紅細胞，靶形、球形、橢圓形紅細胞，多嗜色性紅細胞等?？筛鶕t細胞形態初步判斷地中海貧血。如HbH病的靶形紅細胞較多，紅細胞碎片少見。

1.3紅細胞滲透脆性試驗。即測定紅細胞處于不同濃度的低滲鹽水溶液中，從開始溶血到完全溶血的界限，主要取決于紅細胞表面積與其體積比。因地中海貧血的紅細胞膜存在形態異常，故地中海貧血患者紅細胞脆性降低[4]。一些醫院使用紅細胞脆性一管定量法進行α-地貧的篩查[5，6]。把平均紅細胞體積(MCV)測定法與紅細胞脆性一管法結合，對輕型地貧具有較好的篩查作用[4，7]。

1.4不穩定血紅蛋白測定:(1)異丙醇沉淀試驗，含不穩定血紅蛋白的血標本在加入異丙醇后很快渾濁，并形成絨毛狀沉淀。血紅蛋白H可出現陽性特征。(2)熱變性試驗，根據不穩定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性的特性，在50℃時對不穩定血紅蛋白進行篩查。α-地中海貧血時沉淀量偏高。本法敏感性不高，但特異性較異丙醇試驗高。(3)紅細胞包涵體試驗，不穩定血紅蛋白易變性沉淀形成包涵體。變性珠蛋白包涵體對診斷α-地中海貧血HbH病是一項簡易、方便且特異性較高的方法，當HBH含量較少使血紅蛋白電泳未見HbH區帶時，而可檢測包涵體為陽性。同時對α-地中海貧血1與α-地中海貧血2的診斷也有重要意義。

1.5血紅蛋白分析:診斷地中海貧血中的各種血紅蛋白，并對其進行定性、定量分析。(1)血紅蛋白電泳，因各種血紅蛋白均帶電荷，其等點電均在7以下，故在PH8.5的緩沖液中各種血紅蛋白均帶負電荷，在電場的作用下都向陽極運動，不同的血紅蛋白，其等電點不同，電泳速度不一，故可用電泳分離定性。應用醋酸纖維薄膜作為電泳固相支持物，還可對電泳分離出的不同血紅蛋白進行定量分析。(2)毛細管電泳(CE)，CE是一類以高壓直流電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據式樣中各組分之間的淌度和分配行為的差異而實現分離、分析的新型液相分離技術。有分析速度快，靈敏度高，分辨率高，重現性好，樣本用量和試劑消耗少，自動化程度高等特點。但因CE儀器只能做單個樣本分析，其平均速度不能同醋酸纖維薄膜電泳相比。(3)高效液相色譜(HPLC)，現已用于定量分析血紅蛋白A2及抗堿血紅蛋白。(4)珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳，用尿素將血紅蛋白解離成多肽鏈，通過聚丙烯酰胺電泳的電荷效應與分子篩效應，將各種肽鏈分離，形成不同的區帶，當各種珠蛋白鏈的合成量或結構發生異常時，其珠蛋白鏈區帶相互間的含量比例或電泳遷移率可出現與正常不同的改變，通過各區帶間含量比例的測定，可了解各珠蛋白基因表達的信息，可檢測出大部分的α-地中海貧血患者。

2基因診斷法隨著分子生物學的發展，越來越多的證據表明，遺傳病的發生不僅與DNA結構有關，而且與轉錄水平或翻譯水平的變化相關。基因診斷的探測目的物至少包括DNA和mRNA。因為α-地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血，大部分α-地中海貧血是由于α-基因缺失所致。故可運用基因診斷法對α-基因進行檢查。1983年Mullis建立PCR技術，多年來，這種技術在實際運用中發揮了重要的作用，為遺傳病的診斷提供了更加可靠的依據[8-9]。

我國對地貧的基因診斷始于20世紀80年代初，先后經歷了DNA點雜交、限制性內切酶酶譜分析、限制性片段長度多態性(RFL P)連鎖分析、寡核苷酸(A SO)探針雜交和PCR體外基因擴增等5個發展階段，特別是PCR及其相關發展技術，已成為最普遍的基因診斷方法。

2.1聚合酶鏈反應(PCR):PCR是利用DNA聚合酶等在體外條件下，催化一對引物間的特異DNA片段合成的基因體外擴增技術。應用血紅蛋白電泳檢測對血紅蛋白H病能進行較好的診斷，但對標準型和靜止型的α-地貧不能進行有效診斷。以PCR為基礎的診斷方法已應用于α-地貧的基因診斷[10，11]，并經歷了單重[12]、雙重[13]至多重[14]幾個階段。

多重PCR它的特點是在一個PCR體系中包含4對等位基因特異引物。根據每個突變位點的特異擴增帶來判斷結果。在診斷各種缺失型α-地中海貧血時，相對于傳統的Southern

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雜交技術，操作簡單，周期短，不使用放射性核素，便于臨床推廣[15]。

多重PCR已廣泛應用于實驗室診斷，單管可同時對東南亞、左缺和右缺進行檢測，特別是對靜止型的α-地貧可進行有效檢測。

2.2Southern印記雜交法:鑒別DNA靶分子的雜交稱為Southern印記雜交，是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉印并結合到一定的固相支持物上，然后用標記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。

2.3寡核苷酸(ASO)探針檢測法:ASO探針靈敏度高，可以分析樣品間的單個堿基變化，最早被用來做遺傳性疾病特定突變的檢測。本方法將待檢DNA樣品點在硝酸纖維素膜上，然后與特定的ASO探針雜交，以檢測點突變或缺失引起的遺傳性疾病。此技術的缺點是必須嚴格控制雜交條件，否則會出現假陽性或假陰性，另一缺點是成本高[17]。

2.4RFLP連鎖分析法:因突變導致限制性內切酶酶切位點消失或形成，從而導致相應的DNA酶切片段的改變，這在群體中表現為限制性片段長度多態性(RFLP)。當探針跨越酶切位點時[16]，可在突變點兩側設計引物，使PCR產物含有該突變序列，也可以通過改變引物序列使擴增產物中產生(或消失)酶切位點。用相應的內切酶對正常產物和突變產物進行水解并電泳分離，從而檢測地貧基因。

2.5基因芯片:根據基因芯片上不同位置所出現的熒光位點顏色及強弱的變化來判斷地中海貧血的基因突變類型，與傳統方法比較，基因芯片診斷技術在核酸擴增的基礎上，采用熒光標記及引物延伸的方法，可提高檢測結果的敏感性和特異性，由于基因芯片高通量特點，可將α、β地中海貧血基因診斷在一張芯片上完成，適用于大面積普查[18]。缺點是芯片造價成本較為高昂，還未能廣泛使用于臨床檢驗。

近年隨著分子生物學和蛋白組學實驗技術迅猛發展，α-地中海貧血的實驗室診斷技術亦隨之提高。大量的新技術，新方法被應用于α-地中海貧血的實驗室診斷中。為做好實驗室診斷，在篩查攜帶者、遺傳咨詢、產前診斷、選擇性流產等方面起到了重要作用。及早的防治地貧，直接關系到人民的健康。為使α-地中海貧血的診斷更方便、更快捷、更便宜，為提高地中海貧血診斷的準確性，減少誤診和漏診，需要要已有的實驗技術綜合應用，開陳出新，盡力創造最為適合患者診斷的實驗手段。

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