人胚胎胰腺發育中巢蛋白陽性細胞表達的變化

【摘要】目的:探索人胚胎發育過程中胰腺巢蛋白(nestin)陽性細胞表達的變化。方法:應用免疫組織化學EnVision法，檢測30例人胚胎胰腺組織中巢蛋白陽性細胞的表達及分布變化。結果:各胎齡段(10～37w)胰腺均有巢蛋白陽性細胞表達，存在于胰島、間充質和血管中，在腺泡、導管中未發現陽性細胞，胚胎發育晚期階段(29～37w)巢蛋白陽性細胞高于其它胎齡組。結論:在人胚胎胰腺組織中存在著巢蛋白陽性細胞，該細胞主要分布于胰島和間充質中。隨著胎齡的變化，胰腺巢蛋白陽性細胞數也發生了變化。

【關鍵詞】巢蛋白;人胚胎;胰腺;陽性細胞

【中圖分類號】R321【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)10-015-2

胰腺干細胞移植可以用來治療糖尿病，尋找可供移植的胰腺干細胞是近年來人們關注的熱點。巢蛋白(nestin)是1990年由lendahl等鑒定出來的，屬于第Ⅵ族中間絲蛋白，Mr為240000，是神經干細胞和祖細胞的標志物，也是胰島干細胞的標志之一[1-2]。雖然已有學者對胚胎胰腺中nestin陽性細胞的表達做過研究，但僅局限在12～16周的胚胎胰腺[3-4]。對于胚胎胰腺發育過程中的階段性表達及分布變化尚未見報道。本實驗用免疫組織化學EnVision二步法，對31例10～37w人胚胎胰腺中nestin的表達進行了檢測，了解其在不同胎齡胰腺中表達的差異性，探討其生物學意義，為臨床胰腺移植供體的選擇和胰腺干細胞提取提供形態學資料。

1材料和方法

1.1材料和分組收集因故終止妊娠的正常胎兒31例，分成3組。A組10～19w10例，B組20～28w11例，C組29～37w10例，各胎兒均取其胰尾，入Bouin液固定20～40h，石蠟包埋制成5μm厚的連續切片。

1.2方法nestin免疫組織化學采用EnVision二步法，nestin單克隆抗體為Santa Cruz公司產品，試劑盒為DAKO公司產品。主要染色步驟:常規石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育20min，封閉內源性過氧化物酶，92～100℃枸椽酸緩沖液抗原修復20min，冷卻20min;1:100工作濃度的nestin單克隆抗體4℃冰箱過夜;PBS沖洗3次，每次5min;滴加EnVision液室溫孵育30min;PBS沖洗3次，每次5min;DAB顯色，鏡下控制時間，自來水沖洗;蘇木精復染，酒精梯度脫水，二甲苯透明并中性樹膠封片。空白對照以0.01mol/L PBS代替一抗血清進行免疫組織化學反應。Olympus CX31光學顯微鏡下觀察并數碼相機拍照。

1.3判斷標準為每張切片連續觀察5個高倍視野，在含有胰島的高倍視野中計數100個細胞中nestin陽性細胞數，取其平均值。所有數據采用SPSS 11.5 for Windows統計軟件進行隨機區組方差分析。計量數據以均值±標準差(-x±s)表示。

2結果nestin陽性細胞呈深棕黃色，定位于細胞質。

圖1 胎胰10w原始胰管和間質nestin陽性細胞EnVision法×400

Fig1 positive staining of nestin in primitive pancreatic ducting and mesenchymal cell(10week old embryo)，EnVision，×400

圖2 胎胰16 w nestin陽性細胞EnVision法×100

Fig2 Positive staining of nestin in embryonic pancreas(16week old fetus)，EnVision，×400

2.1A組:胚胎胰腺10w時出現了原始胰管，這些原始胰管nestin全部弱陽性表達，但間充質中出現大量的nestin強陽性細胞，表達率達99%以上，因未觀察到胰島，故該例未列入統計范圍(圖1)。11w后胰腺內結締組織增多，出現未形成明顯腺腔的腺泡，胰島大、小不一，14周之后胚胎胰腺中可見明顯的小葉結構，能分辨出腺泡、導管和胰島。胰島中出現較多陽性細胞，陽性細胞分布散在，周邊和中心均有;陽性部位在細胞內呈現波形分布，在核周圍聚集，呈放射狀發散。在胰腺的間充質、血管中也有許多陽性細胞，但未發現在腺泡和導管中的陽性細胞(圖2)。B組:胚胎20～28w中可見胰島的數量在增加，胰島中有nestin陽性細胞，腺泡和導管中無陽性細胞，間充質中存在陽性細胞，分布于血管內皮細胞、血管壁的平滑肌細胞中。C組:29～37w胚胎中可見胰腺的外分泌部和內分泌部結構更明顯，胰島數量多，nestin陽性細胞比前階段增多，間充質、血管中均出現nestin陽性細胞，存在于血管內皮和外層結構中，腺泡中無陽性細胞，導管中上皮外有陽性細胞(圖3)。

圖3 胎胰32 w nestin陽性細胞EnVision法×100

Fig3 Positive staining of nestin in embryonic pancreas(32 week old fetus)，EnVision，×100

2.2經隨機區組設計的方差分析，顯示B組nestin陽性細胞率最低，A組與B組、C組相比較有顯著性差異(P<0.05)，B組與C組相比無顯著性差異(P>0.05)。

附表 胚胎胰腺nestin陽性率比較(-x±s)

Tab Positive rate of nestin in embryonic pancreas(-x±s)

Group nPositive rate of nestin

A 919.16± 6.0

B 11 17.64± 4.6*

C 10 23.14± 5.9*

* 與A組相比較P<0.05

3討論

3.1早在1985年Hockfield和Mckay首先發現巢蛋白在胚胎大鼠脊髓神經管神經前體細胞表達。該基因編碼的蛋白歸于中間絲蛋白，參與細胞骨架的構成。在小鼠的胚胎發育過程中，當神經胚形成時，神經板皮層細胞開始表達巢蛋白;神經細胞的遷移基本完成后，巢蛋白的表達量下降，這表明巢蛋白主要在未分化、具有分裂能力的細胞中表達，有時間順序性，故亦將其稱為神經上皮干細胞蛋白[5]。之后Hunziker等[6]首先發現在胰腺內有巢蛋白陽性細胞。Lumelsky等[7]發現巢蛋白可以作為多潛能的胰腺干細胞的標志。胰腺干細胞能在自然分化過程中首先分化為胰腺組織的各種細胞。體外分離克隆胰腺干細胞作為種子細胞，并定向誘導其分化為功能性胰島移植治療糖尿病，是解決胰島供體短缺的有效途徑。因此檢測胰腺中的巢蛋白陽性細胞并對其進行分離、體外增殖、誘導分化及克隆成為人們研究的熱點之一[8-9]。但對人胚胎胰腺發育過程中巢蛋白表達的變化尚未見報道。

3.2本實驗顯示人胚胎10w時胰腺原始胰管中nestin高表達，呈弱陽性，間充質中呈強陽性，說明此時胰腺處于未分化狀態、細胞的分裂能力強，這可能與原始胰管分裂增殖演變成胰島原基有關[10]。14w以后胚胎胰腺中的nestin陽性細胞表達已有明顯的區分，只存在于胰島與間充質中，這與夏修金等[3]的部分結果相似，但我們未發現在腺泡和導管中的陽性細胞。在胚胎發育的中期20～27周胚胎胰腺中的nestin陽性細胞呈下降趨勢，可能與第二代胰島形成，胰腺已經能分泌胰島素和胰液相關，表明部分細胞已分化成熟而出現陽性率下降的現象。Lardon等[11]通過免疫組化發現，巢蛋白陽性細胞定位在正常和再生成年胰腺的間充質細胞內。在小鼠胚胎胰腺18、21d，巢蛋白陽性細胞被發現在所有血管的內皮細胞，包括胰島毛細血管;胚胎胰腺15d巢蛋白陽性細胞散在于胰腺間充質。巢蛋白并沒有在導管上皮中被發現。Selander等[12]研究也表明，在小鼠胰腺中，巢蛋白在間充質中表達，不在上皮細胞中表達。這與我們的研究結果相似。28周后巢蛋白的陽性表達率上升，與早、中期相比較有統計學意義，并且在胰島中的陽性細胞量明顯增多，說明此時胚胎胰腺的分化增殖能力很強，內分泌細胞增殖迅速，這與我們以前的研究結果是相符的，即胚胎發育晚期細胞的增殖能力強[10]。胚胎胰腺巢蛋白陽性細胞在胰島細胞中的表達部位與成人是相似的[13]。

3.3本實驗首次報導nestin陽性細胞在人胚胎胰腺發育過程中的表達變化，nestin陽性細胞在胚胎中期的胰腺中表達最低，晚期表達最高。結合前期文獻資料，認為巢蛋白是在胚胎胰腺發育過程中存在的胰腺干細胞，也代表著胰腺的增殖水平。實驗提示，從人胚胎后期胰島中可分離得到更多的巢蛋白陽性細胞，更容易獲得大量的干細胞而進行篩選、體外培養及誘導分化，從而為糖尿病胰腺干細胞移植提供了更多的細胞來源。

參考文獻

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