滋腎化瘀祛痰湯對多囊卵巢綜合征大鼠胰島素抵抗相關性的影響研究

【摘要】目的:觀察滋腎化瘀祛痰湯對多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠胰島素抵抗相關性的影響并分析其可能的作用機制。方法:規律發情周期SD雌性大鼠50只，應用人絨毛膜促性腺激素(HCG)聯合胰島素(INS)造模法制作動物模型，隨機分為正常對照組、模型對照組、二甲雙胍組、滋腎化瘀祛痰湯組和益腎導痰調沖湯組。運用放免法測定血清性激素水平的變化，光鏡觀察卵巢組織形態學改變，免疫組化法檢測卵巢組織INR和IGF-1R表達水平。結果:滋腎化瘀祛痰湯能使PCOS大鼠卵巢囊狀卵泡減少，顆粒細胞形態恢復完整、排列整齊，卵泡膜細胞層變厚，黃體組織增多;血清T、FSH、LH、INS水平明顯下降(P<0.05)，并下調卵巢組織IGF-1R，增高INR表達。結論:滋腎化瘀祛痰湯通過調整內分泌及影響IGF-1R及INR的表達，改善PCOS大鼠的高胰島素血癥和胰島素抵抗，促進卵泡的發育成熟及排卵。

【關鍵詞】滋腎化瘀祛痰湯;多囊卵巢綜合征大鼠;胰島素抵抗;高胰島素血癥

【中圖分類號】R285.6【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)10-037-3

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女常見的一種發病多因性，臨床表現呈多態性的異質性內分泌紊亂疾病。據報道，PCOS在育齡婦女中的發病率為6%～10%，是造成不孕的重要原因之一，占無排卵性不育病因的50～70%[1]。中醫學中無“多囊卵巢綜合征”病名，根據其主要臨床表現當屬祖國醫學“月經后期”、“閉經”或“崩漏”、“不孕”等范疇。現代中醫治療多囊卵巢綜合征多采用辨病與辨證相結合，本實驗所用方藥是以滋腎陰為主，兼祛瘀化痰，調理沖任為治則創立的治療腎陰虛痰瘀互阻型PCOS的有效方劑，臨床中多用于PCOS中偏于高胰島素血癥和胰島素抵抗型的患者。本實驗運用放射免疫、免疫組化等技術，觀察中藥滋腎化瘀祛痰湯對PCOS大鼠內分泌、卵巢形態學及其IR改善情況的影響;重點研究IGF-1R、胰島素受體(INR)在卵巢的表達，以從細胞分子學水平探討其對PCOS胰島素抵抗的作用，為滋腎化瘀祛痰湯的臨床應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選用6-7周齡的Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠。SPF級，由溫州醫學院實驗動物中心提供和飼養。每日光照12小時，喂以大鼠顆粒飼料。

1.1.2藥品與試劑①滋腎化瘀祛痰湯、益腎導痰調沖湯:由溫州中山醫院中國中西醫結合學會生殖醫學不孕不育研究所提供、制備，4～10℃保存待用。②二甲雙胍片:0.25g/片，貴州天安藥業。③中性胰島素注射液:10ml:400單位，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司。④注射用人絨毛膜促性腺激素:注射用絨促性素1000IU/瓶，麗珠集團麗珠制藥廠。⑤血清睪酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)、促黃體生成素(LH)、胰島素(INS)放免試劑盒，博士德生物工程有限公司產品。⑥INR、IGF-1R免疫組化試劑盒:博士德生物工程有限公司產品。

1.2方法

1.2.1模型制備及分組

SD大鼠，雌性，體重180～200克(6～7周齡)，進行陰道涂片確定規律發情周期;兩周后，選擇規律發情周期大鼠50只，體重240～260克(8～9周齡)，隨機分為正常對照組(n=10)和病理模型組(n=40)。正常對照組第1～10天皮下注射生理鹽水0.2ml，每日一次;第11～22天皮下注射生理鹽水0.2ml，每日兩次。采用Poretsky造模法[2]，制作PCOS大鼠模型。病理模型組第1～10天股骨內側皮下注射中性胰島素注射液(溶于生理鹽水共0.2ml)，每日一次，由0.5IU遞增至6.0IU(表1);第11～22天持續6.0IU劑量;同時第11～22天皮下注射HCG3IU(溶于生理鹽水共0.2ml)，每日兩次，實驗周期為22天。所有實驗動物給予自然光照及自由飲食飲水(處理前為普通飲用水，處理期間為5%葡萄糖水)，并繼續每日進行陰道涂片以監測發情周期。

1.2.2給藥方法

造模完成后將上述病理模型組(n=40)又隨機分為模型對照組(n=10)、二甲雙胍組(n=10)、滋腎化瘀祛痰湯組(n=10)、益腎導痰調沖湯組(n=10)，第23天開始分別灌胃予對應劑量的藥物。在給藥劑量上按人鼠體重比換算后乘以人與大鼠體重換算系數6.25，換算后大鼠給藥量為:二甲雙胍組0.16g/kg·d;滋腎化瘀祛痰湯中劑量組(兩倍量)46.90g/kg·d;益腎導痰調沖湯中劑量組47.92g/kg·d;而正常對照組與模型對照組給予生理鹽水10ml/kg·d，連續灌胃14天后處死。正常對照組和模型對照組與兩中藥組比較，觀察中藥療效;正常對照組與模型對照組比較，觀察造模情況。并繼續每日進行陰道涂片以監測發情周期。

1.2.3檢測項目及方法

(1)卵巢組織病理檢查:大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后取出雙側卵巢，修剪后將卵巢以其長徑剖開，10%甲醛溶液常溫固定24小時以上，送病理科石蠟包埋。以卵巢最大平面作為待檢平面切片，分別以4μm厚度切片兩次(間隔40μm)。

(2)激素檢測:心臟取血，3000r/min離心10min，收集血清樣品，-20℃保存，應用放射免疫法(RIA)測定血清中卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)、和INS的含量。

(3)免疫組化分析:應用SABC法分析卵巢組織中INR和IGF-1R的表達，

1.2.4應用SPSS11.5統計軟件進行方差分析。

2結果

2.1卵巢病理檢查肉眼觀察:正常對照組卵巢色澤紅潤;模型對照組卵巢表面較蒼白，體積增大，見較多囊狀擴張的卵泡;兩中藥組卵巢色澤較模型對照組紅潤;二甲雙胍組與模型對照組無差異。鏡下觀察:正常對照組可見不同發育階段卵泡及多個黃體，無囊性卵泡出現;顆粒細胞形態完整，排列整齊，卵泡膜無顯著增生。模型對照組及二甲雙胍組標本中可見囊性擴張卵泡，竇腔擴大，放射冠消失;顆粒細胞層數減少排列稀疏，卵泡膜細胞顯著增生及間質細胞增生。兩中藥組囊狀卵泡明顯減少;顆粒細胞層數較模型對照組明顯增多，顆粒細胞形態完整，排列整齊，卵泡膜細胞層變薄，黃體組織數量增多。滋腎化瘀祛痰湯組較益腎導痰調沖湯組改善更明顯。

2.2血清激素的測定模型對照組血清T、FSH、LH、INS較正常對照組明顯升高(P<0.05);滋腎化瘀祛痰湯組血清T、FSH、LH、INS和二甲雙胍組、益腎導痰調沖湯組血清T、LH、INS較模型對照組明顯降低(P<0.05);各組間血清E2均無顯著性差異。(表1)

2.3卵巢組織IGF-1R和INR的表達模型對照組顆粒細胞IGF-1R表達明顯強于正常對照組(P<0.05)，兩中藥組IGF-1R表達較模型對照組明顯降低(P<0.05)，二甲雙胍組與模型對照組間、兩中藥組間無顯著性差異。模型對照組INR表達明顯低于正常對照組(P<0.05)，滋腎化瘀祛痰湯組較模型對照組、益腎導痰調沖組均明顯增高(P<0.05)，二甲雙胍組、益腎導痰調沖湯組與模型對照組間均無顯著性差異。(圖略)

3討論

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種以內分泌紊亂為主，多種代謝異常的異質性臨床綜合征。臨床特征多樣，主要呈現為卵巢的多囊性改變、排卵障礙所致的月經稀發或閉經、高雄激素血癥和LH/FSH比值增高以及不孕、多毛、痤瘡、肥胖和黑棘皮癥等，并常伴胰島素抵抗、高胰島素血癥或高脂血癥。基于以上的觀點，本實驗選擇INS6IU聯合HCG6.0IU劑量誘導成年大鼠PCOS模型。陰道細胞學檢查發現模型大鼠的動情周期失去規律性變化;卵巢病理檢測發現大鼠卵巢呈多囊性改變，鏡下可以看到早期發育的較多的小卵泡，囊狀擴張的卵泡明顯增加，卵泡顆粒細胞減少而膜細胞層增加，卵泡內卵母細胞或放射冠消失，黃體數量明顯下降。同時內分泌激素水平的改變也支持HCG聯合INS誘導模型更符合人PCOS:T、LH和INS水平明顯升高、E2水平無改變。睪酮的上升反映了高胰島素在持續恒定的高LH水平中導致高雄激素血癥。FSH水平升高，與人PCOS的病理改變不符，可能與造模對大鼠生殖內分泌系統的影響與人PC0S的發病機理不同有關，也說明本模型存在著垂體內分泌功能紊亂。

本實驗應用HCG以模擬PCOS的高LH水平，觀察到大鼠造模及用藥前后血清激素水平的變化。造模后血清T水平顯著升高，而高雄激素血癥是PCOS的基本病理生理改變。藥物治療組的LH、T水平均低于模型組，說明:二甲雙胍能使INS水平下降，減輕胰島素對LH的刺激作用，使LH水平下降，LH/FSH比值降低。二甲雙胍還可增加SHBG的合成，從而使游離T的濃度下降，有效改善機體的激素紊亂，但二甲雙胍并無促排卵作用，其它數據的改善不如兩中藥組;兩中藥組也明顯改善了多囊卵巢綜合征異常的內分泌環境，其對血清激素的影響可能是通過對下丘腦-垂體-卵巢軸以及卵巢局部的調節而起作用，其具體作用環節還有待進一步深入研究。但兩中藥組比較血清激素水平的變化無明顯差異。

本實驗通過觀察IGF-1R來間接評價IGF-1的表達情況。有研究認為卵巢卵泡膜細胞分泌IGF-1，而顆粒細胞不合成IGF-1[3]。本組實驗觀察到:模型對照組大鼠卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞和間質細胞IGF-1R均有表達。正常對照組大鼠和模型對照組大鼠卵泡膜細胞均表達IGF-1R，小卵泡和閉鎖卵泡的顆粒細胞也表達IGF-1R，且模型對照組顆粒細胞表達比正常對照組強。兩中藥組IGF-1R表達較模型對照組明顯降低，二甲雙胍組與模型對照組間、兩中藥組間無顯著性差異。梁曉燕[4]等證實局部高濃度的INS及IGF-1均會對雄激素的產生起到加強的作用。IGFs可以增強卵泡膜細胞對LH的反應，反饋抑制生長激素(GH)分泌，因而可能在PCOS發病中起作用[5]。李佳玲等[6]觀察補腎中藥對雄激素致不孕大鼠IGF-1及IGF-1R的影響，推測大鼠的這種高雄激素狀態為補腎中藥所糾正的機理可能是通過調節IGF-1其受體來實現的。研究結果提示滋腎化瘀祛痰湯可能通過調節大鼠卵巢IGF-1R來改善PCOS大鼠胰島素抵抗情況。胰島素受體(INR)為卵巢中胰島素起作用的靶細胞膜上特定部位，僅可與胰島素或含有胰島素分子的胰島素原結合，具有高度的特異性。本實驗觀察到:模型對照組大鼠卵巢中胰島素受體的表達比正常對照組顯著降低，二甲雙胍組比模型組略有升高，但無統計學意義;滋腎化瘀祛痰組與模型對照組比較有顯著性差異;益腎導痰調沖組與模型對照組比較無統計學差異。結果提示滋腎化瘀祛痰湯可升高大鼠卵巢中INR的數目。高胰島素血癥導致高雄激素血癥的機理是胰島素通過直接結合卵巢上的INR和IGF-1R完成。本實驗觀察到:血清中胰島素的下降與胰島素受體的增加呈負相關。

腎藏精，為先天之本，主人體的生長發育與生殖。在女子生長發育的過程中，腎具有主導地位。腎為天癸之源，腎氣的盛衰主宰天癸的至與竭。腎主生殖，女子發育到一定時期，腎氣旺盛，天癸泌至，促進經、胎、產的生理功能即腎中所藏精氣以及腎精所化精血為胞宮的行經和胎孕提供物質基礎。故腎虛是排卵障礙的根本原因。痰濁血瘀亦是PCOS發生的病機。腎虛癸水不足，卵子發育不能成熟，痰瘀阻滯，壅阻沖任胞脈，氣血凝滯成癥，使卵子難以排出、卵巢增大、呈多囊樣變化。腎虛痰瘀互為因果。中醫治療多囊卵巢綜合征多采用辨病與辨證相結合，在很大程度上提高了療效，顯示了中醫藥治療本病的獨特優勢。程涇教授根據多年臨床經驗與辨病辨證相結合，將PCOS分為:①腎(脾)陽(氣)虛痰阻，②腎陰虛夾瘀痰，③腎虛肝旺型。總之，PCOS與腎虛、氣血瘀滯、痰濕壅阻密切相關，其中部分患者表現為腎陰虛痰瘀阻滯，臨床多為高胰島素血癥和胰島素抵抗型。對于本病的治療，滋腎養陰佐以活血祛瘀，化痰消徵是治療PCOS中高胰島素血癥和胰島素抵抗的基本原則。大量實驗及臨床研究發現，PCOS伴有明顯的胰島素抵抗與高胰島素血癥，且隨著年齡增加而惡化，高胰島素血癥己明確可引起高雄激素血癥，降低體內胰島素水平與PCOS的治療效果有關。從本研究的結果可以推測，滋腎陰化瘀祛痰調沖法可能是通過調整內分泌及影響IGF-1R及INR的表達，改善PCOS大鼠的高胰島素血癥和胰島素抵抗，促進卵泡的發育成熟及排卵達到治療目的。程涇教授通過多年臨床觀察總結經驗方滋腎化瘀祛痰湯，治療PCOS中表現腎陰虧虛、痰瘀阻滯證型偏于高胰島素血癥、胰島素抵抗患者。方中滋腎養陰功在龜板、枸杞、生熟地、石斛、麥冬，陽中求陰加用巴戟天、菟絲子，清熱化痰主用全瓜蔞、山慈菇，活血化瘀調經則用當歸、赤芍、桃仁、香附、茺蔚子，佐以甘草調和諸藥。全方著眼于腎、陰、瘀、痰。補腎養陰、清熱祛痰、活血化瘀調經，使腎(陰)充、沖任調和、氣血通暢、月經如期，以能攝精成孕。

PCOS本就是一個臨床表現多樣，病因復雜的異質性疾病，在辨病的前提下應用中醫的辨證論治原則尋求個體化治療已成為一大趨勢。近年來治療PCOS均以補腎為基本大法，多從腎陽虛辨治，但部分PCOS患者以腎陰虛痰瘀阻滯表現為主，這部分患者臨床常表現為高胰島素血癥和胰島素抵抗，對于這些患者以滋腎化痰祛瘀調沖為治則，療效顯著。本實驗觀察發現滋腎化瘀祛痰湯組各項指標的改善情況比益腎導痰調沖湯[7]組好，間接說明辨證論治注重個體化治療的重要性。兩中藥組無顯著性差異，可能由于樣本過少的原因。

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參考文獻

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