喬納金和陸奧蘋果的花粉形態(tài)及胚胎發(fā)育觀察

摘 要：運(yùn)用掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對蘋果三倍體品種喬納金、陸奧及其母本金冠的花粉形態(tài)、大小、萌發(fā)孔、外壁紋飾及其胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察研究，結(jié)果表明，喬納金、陸奧的花粉量均少于金冠，且畸形率均高于金冠。三倍體蘋果花粉側(cè)面觀為長橢圓形，極面觀為三角形，具3縱溝孔；花粉表面為縱向條狀紋飾，有穿孔。喬納金花粉P/E值為1.90，陸奧為1.85，與金冠1.82相比差異不顯著。3個品種均為蓼型胚囊，喬納金、陸奧的胚囊均存在不同程度的異常，包括雙胚囊，珠心細(xì)胞異常，極核位置異常和胚囊發(fā)育停滯。

關(guān)鍵詞：蘋果；三倍體：花粉：胚胎

中圖分類號：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)05-667-06

果樹多倍體一般具有生長旺盛、果實大且少子或無子、產(chǎn)量高、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等特點。有關(guān)葡萄、板栗、菠蘿、棗等自然產(chǎn)生的多倍體或誘變多倍體的研究曾有報道，但利用掃描電鏡對蘋果多倍體進(jìn)行觀察研究，目前研究報道很少。激光掃描共聚焦顯微鏡可對組織和細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)光學(xué)切片，構(gòu)建立體三維結(jié)構(gòu)，是研究植物胚囊的形成與發(fā)育過程以及胚囊變異的理想工具。王穎等曾運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡對平邑甜茶后代的胚胎發(fā)育進(jìn)行研究，運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡對蘋果栽培品種的胚胎發(fā)育研究報道甚少。我們采用掃描電子顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡對蘋果三倍體品種喬納金、陸奧及其母本金冠的花粉粒形態(tài)、大小、萌發(fā)孔、外壁紋飾等孢粉學(xué)特性及胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察比較，以期為蘋果品種的倍性鑒定、多倍體的進(jìn)化和多倍體育種提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為19 a生的三倍體蘋果品種喬納金(Jonagold)、陸奧(Mutsu)及其母本二倍體品種金冠(Golden Delicious)，砧木為八棱海棠(Malus robus-ta)。定植于山東省泰安市岱岳區(qū)夏張鎮(zhèn)王家小莊果園，生長結(jié)果正常。土壤為沙壤土。

2007年4月在蘋果花大蕾期采集花蕾，取其花藥。經(jīng)室溫風(fēng)干后收集花粉。胚胎于花前一天取花期相對一致的花朵進(jìn)行人工授粉后開始取樣，每天取樣1次，直至花后10d，每次每個品種取30朵花。

1.2 方法

試驗在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析中心進(jìn)行。

1.2.1 掃描電子顯微鏡法觀察花粉取少許晾干后花粉黏于雙面膠上，噴金鍍膜后，置于日立S-450掃描電鏡下觀察，選取典型的花粉粒拍照。取6個不同的視野，每個視野選5個方位一致、典型的花粉調(diào)查花粉粒的極軸及赤道軸的長度。在200倍下對花粉粒大群體進(jìn)行拍照，在1 000倍下對花粉粒小群體進(jìn)行拍照，在2000倍下，分別對花粉粒的雙溝側(cè)面、單溝側(cè)面和極面進(jìn)行拍照，每品種取6個典型的花粉在5000倍下對花粉紋飾拍照。每項指標(biāo)調(diào)查30個數(shù)據(jù)，通過DPS7.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡法觀察胚胎取樣后以FAA固定液固定24～48 h，后轉(zhuǎn)入70％乙醇中4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼灂r梯度復(fù)水后(50％、30％、10％乙醇、蒸餾水)用4％蔗糖曙紅溶液染色12～48h，水洗3次后乙醇梯度脫水(10％、30％、50％、70％、90％、100％)。50％水楊酸甲酯透明2h后轉(zhuǎn)入100％水楊酸甲酯中透明12～48h。水楊酸甲酯封片，Zeiss510型激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，獲取圖像，LSCM Image Examiner軟件處理圖像。

2.2 胚胎發(fā)育研究

2.2.1 胚胎發(fā)育特征 從對喬納金、陸奧和金冠胚囊發(fā)育的觀察結(jié)果可以看出，這3個品種在胚胎發(fā)育過程中表現(xiàn)出來的特征大體相同，多數(shù)子房胚囊結(jié)構(gòu)正常，為蓼型結(jié)構(gòu)的胚囊。能性大孢子經(jīng)有絲分裂為二核胚囊、四核胚囊再分裂形成八核胚囊。表現(xiàn)為珠孔端由1個卵細(xì)胞和2個助細(xì)胞組成卵器，卵器上方2個極核。合點端是3個反足細(xì)胞。在授粉后3-5 d觀察到了精核或花粉內(nèi)容物(圖版Ⅱ-D1～E5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉特性

2.1.1 喬納金花粉形態(tài)特性 由圖版I-A1～A6可以看出，喬納金的花粉量與金冠相比很少，且畸形花粉多。其花粉粒側(cè)面觀為長橢圓形，極面觀為三角形，3條縱溝孔，長達(dá)兩極；花粉粒表面為縱向條狀紋飾，有穿孔。花粉粒萌發(fā)溝較寬。表面紋飾走向略呈斜向平行，排列較松，有分叉。極軸長47.79um，明顯大于金冠；赤道軸25.39um，與金冠沒有顯著差異。P/E值為1.90。與金冠比較差異不顯著。側(cè)面觀與金冠相比平滑，極面觀不規(guī)則。

2.1.2 陸奧花粉形態(tài)特性

由圖版I-B1～B6可以看出，陸奧的花粉量比金冠的少，畸形花粉比金冠多。其花粉粒側(cè)面觀為長橢圓形，極面觀為三角形，3條縱溝孔，長達(dá)兩極；花粉粒表面為縱向條狀紋飾，有穿孔。花粉粒萌發(fā)溝較寬。表面紋飾走向呈縱向平行。排列較密，分叉多。極軸長43.59um，赤道軸24.09um，P/E值為1.85，與金冠相比，無顯著性差異，側(cè)面觀平滑，極面觀與金冠相比不規(guī)則。

2.1.3 金冠花粉形態(tài)特性 由圖版I-C1～C6可以看出，金冠花粉量最多，且畸形花粉量最少。其花粉粒側(cè)面觀為長橢圓形，極面觀為三角形，3條縱溝孔，長達(dá)兩極；花粉粒表面為縱向條狀紋飾，有穿孔。花粉粒萌發(fā)溝較寬。表面紋飾走向呈縱向平行。排列較密，有分叉。極軸長43.31um；赤道軸24.01um。P/E值為1.82。 2.2.2 胚胎異常現(xiàn)象 在這3個品種中除了大部分-為正常結(jié)構(gòu)的胚囊外，均存在不同程度的異常結(jié)構(gòu)胚囊。但是三倍體品種的胚胎異常比率比金冠高的多。在三倍體品種喬納金和陸奧中觀察到的異常情況是：多個珠心細(xì)胞異常(圖版ⅡF1，F(xiàn)4，F(xiàn)6)、胚囊-發(fā)育停滯(圖版ⅡF2、F3)、極核位置異常(圖版Ⅱ-F5)和雙胚囊(圖版ⅡF7)。

3 討論

3.1 花粉形態(tài)

果樹多倍體的花粉粒形狀與二倍體明顯不同，但已有的研究多為定性的研究，并未獲得衡量多倍體與二倍體花粉粒形狀差異的數(shù)量化指標(biāo)，使得利用花粉粒形狀鑒定多倍體不易進(jìn)行。李貰等用光學(xué)顯微鏡在比較二倍體與三倍體花粉粒形狀分布的基礎(chǔ)上，將三角形花粉粒與圓形花粉粒及方形花粉粒數(shù)目之和的比值用于倍性鑒定之中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該比值在二倍體和三倍體品種間存在顯著差異。因此認(rèn)為，可將該比值作為蘋果倍性鑒定的指標(biāo)之一。徐喜樓等¨。’在用掃描電鏡觀察蘋果屬花粉時發(fā)現(xiàn)，三倍體陸奧的極軸和赤道軸明顯大于二倍體品種。研究中三倍體的喬納金極軸明顯大于二倍體金冠，而與陸奧差異不顯著，赤道軸差異不顯著，這表明三倍體品種并沒有比二倍體金冠大很多。P/E值的大小與起源和進(jìn)化相關(guān)。楊曉紅等在蘋果屬植物花粉觀察研究中得出P/E值越大，越原始的觀點。梁國魯㈦認(rèn)為，多倍體是該屬植物進(jìn)化的一個途徑，而三倍體和四倍體是該屬植物進(jìn)化適當(dāng)?shù)牡燃墶５茄芯恐校瑔碳{金和陸奧的P/E值與金冠差異不顯著，具體原因可進(jìn)一步探討。

在本研究中，喬納金、陸奧的花粉量明顯少于二倍體品種金冠，且畸形花粉也明顯高于金冠。多倍體花粉量少，大小極不均勻，很多花粉粒呈不定型，這與楊曉紅等觀察蘋果屬植物花粉時的結(jié)果一致。Kenneth等舊指出被子植物的花粉敗育主要發(fā)生在四分體以前。顧愛俠等對大白菜和結(jié)球甘藍(lán)雜交獲得的異源三倍體進(jìn)行研究表明，其花粉整齊度、花粉生活力都明顯低于二倍體大白菜。任艷蕊等1對芥藍(lán)一菜心異源三倍體研究表明，其花粉母細(xì)胞大多未能完成減數(shù)分裂和配子形成過程，其花粉生活力的喪失可能主要是染色體數(shù)目和組成不均衡所致。石蔭坪等對三倍體品種伏花皮的花粉母細(xì)胞研究表明，其減數(shù)分裂存在一定的異常現(xiàn)象，在四0分體時期，除了大部分形成四分體外，還存在一定數(shù)量的異常分體，且小孢子有大小不一致的現(xiàn)象。同樣，在胚乳三倍體棗的小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂中也觀察到了不同程度的異常分體。這可能是三倍體品種喬納金和陸奧的花粉量少、畸形花粉多的原因。

3.2 三倍體的胚囊結(jié)構(gòu)

研究結(jié)果表明，三倍體品種正常的胚囊和二倍體品種的胚囊均為蓼型胚囊，這說明雖然倍性增加，但是并沒有改變其發(fā)育過程。但是喬納金和陸奧存在不同程度的異常胚囊現(xiàn)象，可以推測為在大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，除了產(chǎn)生正常的四分體外，還可能出現(xiàn)其他異常分體，極有可能形成非整倍體的功能大孢子，使這部分功能大孢子進(jìn)一步發(fā)育時異常，最后導(dǎo)致成熟胚囊結(jié)構(gòu)出現(xiàn)各種異常。至于具體的原因，可以對其大孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂及發(fā)育進(jìn)一步研究。

胚囊只有具有正常的卯器、極核和反足細(xì)胞等正常結(jié)構(gòu)才能正常受精和結(jié)實，反之則可能不能正常受精和結(jié)實。在本研究中，三倍體品種喬納金、陸奧的胚囊均存在不同程度的異常現(xiàn)象，其中最多的是珠心細(xì)胞發(fā)育異常或停滯，因此無法進(jìn)行正常受精。王蘭等在對同源四倍體水稻胚乳發(fā)育的研究證明極核位置異常是無法正常受精的，所以陸奧中發(fā)現(xiàn)的此類胚囊也是不能正常受精的。因此，胚囊結(jié)構(gòu)異常而不能正常授粉受精可能是喬納金和陸奧的種仁率低于金冠的原因。多胚囊中一般只有1個胚囊發(fā)育完全，其余的胚囊在發(fā)育過程中退化解體。如果復(fù)合胚囊的發(fā)育過程相近則會全部敗育，本研究中喬納金的多胚囊就屬于這種類型。這也可能是其結(jié)實率低的原因。植物種胚敗育在胚胎學(xué)上主要有雌性器官不孕、授粉受精不良、胚中途敗育等。本試驗只是調(diào)查了金冠、喬納金和陸奧的胚囊結(jié)構(gòu)。至于從合子到成熟種子的發(fā)育過程以及外界因子是否是影響其種仁率低，種子敗育的原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過對蘋果三倍體品種喬納金、陸奧及其母本金冠的花粉特性研究表明，三倍體蘋果花粉粒的大部分側(cè)面觀均為長橢圓形，極面觀為三角形，所有花粉粒均有3條縱溝孔，長達(dá)兩極；花粉粒表面為縱向條狀紋飾，有穿孔。但是，飽滿程度有所不同。喬納金、陸奧的花粉量明顯比金冠的少，并且花粉畸形多。三倍體的喬納金極軸明顯大于二倍體金冠，而陸奧差異不顯著，赤道軸差異不顯著。三倍體品種為蓼型結(jié)構(gòu)的胚囊，喬納金、陸奧的胚囊均存在不同程度的異常，包括雙胚囊，珠心細(xì)胞異常，極核位置異常和胚囊發(fā)育停滯。