中國李NUbiana葉柄離體培養再生植株

摘 要：以中國李Nubiana試管苗幼嫩葉片上的葉柄為試材，研究了基本培養基、激素種類配比、暗培養時間、培養基中瓊脂濃度等對葉柄再生的影響，建立了其葉柄再生體系。結果表明，中國李Nubiana葉柄再生不定芽最佳培養基為WPM+TDZ0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂6g·L^-1，不定芽再生率可達到35.0％；暗培養為葉柄不定芽再生的必要條件，暗培養14d后轉入光下培養，能促進葉柄產生不定芽。中國李Nubiana葉柄再生表現出明顯的極性，不定芽一般出現在葉柄的近軸端。

關鍵詞：中國李；Nubiana；葉柄；離體培養

中圖分類號：S662.3 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)05-708-05

建立穩定高效的離體再生技術體系成為開展核果類果樹遺傳轉化研究的基礎和關鍵，但薔薇科李屬植物離體再生困難，長期以來一直是果樹生物技術研究的難點。國內外有關核果類果樹桃、櫻桃、杏_句等的葉片、葉柄植株再生培養研究報道較多，但有關李的研究相對較少。Barhara等分別在2004、2007年對影響歐洲李葉片植株再生的激素種類及濃度、碳源、氮源等因素進行研究，并得到了較適合歐洲李(Prunus domestica)葉片再生的培養基配方：劉崇琪等采用新疆野生櫻桃李(件unuscerasifera)無菌試管苗葉片為試材得到再生植株；許建蘭等采用Damasl869李離體葉片為試材獲得再生植株，不定芽再生率為73.5％。在相關李屬植物葉片再生體系中，尚未見中國李葉柄再生不定芽的研究報道。樊青峰等以中國李Nubiana葉片為試材。對其愈傷組織的誘導、繼代培養及褐變調控進行了研究，誘導出愈傷組織，但愈傷組織未能分化形成不定芽。基于此，我們以中國李Nubiana試管苗幼嫩葉片上的葉柄為試材，研究了再生基本培養基、激素配比、暗培養時間、培養基中瓊脂濃度等對離體葉柄再生的影響，以期建立穩定高效的葉柄再生體系，為進一步開展中國李遺傳轉化研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為中國李Nubiana(Prunus salcina)試管苗，30 d左右繼代1次；繼代培養基：LP+IBA0.06mg·L^-1+6-BA 0.4mg·LL^-1+3g·L^-1。蔗糖+7g·LL^-1。瓊脂，pH值為5.90-6.00。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 (1)再生培養基：采用WPM、LP、MS 3種不同類型的基本培養基；(2)激素配比：細胞分裂素用TDZ，生長素用2，4-D從不同濃度范圍進行組合；(3)暗培養時間：設計不同暗培養時間O、7、14、21、28 d；(4)瓊脂濃度：設計4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 g·L^-1等幾種瓊脂濃度。

1.2.2 再生培養 繼代培養3周左右生長健壯的無菌試管苗，取上部較嫩的2～5枚展開葉片的葉柄，接種在各誘導培養基上。再生培養基除特殊說明外一般用WPM+TDZ0.5 mg·L^-1蔗糖30g·L^-1+瓊脂6g·L^-11，pH值為5.90～6.00，除TDZ為過濾滅菌之后加入外，其他成分均在高壓滅菌前加入。

1.2.3 生根培養 離體葉柄誘導再生苗長到1.5cm左右轉入繼代培養基(培養基配方和培養方法同前述1.1試管苗的培養)，繼代培養1-2次后轉入生根培養基誘導生根。生根培養基配方為1/2MS+IBA0.5mg·L^-1。

1.2.4 培養條件 培養室溫度為(25±2)℃，光照強度2000-3000lx，光照周期16h光照/8h黑暗。葉柄誘導不定芽，暗培養14d后光下培養0。

1.2.5 數據統計分析 每個試驗處理接種20個外植體，重復3次。葉柄接種于再生培養基后對葉柄再生不定芽的形態分化過程進行觀察，并在35d對不定芽再生率進行統計。試驗數據用SAS軟件(8.1版本)的ANOVA程序進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不定芽的發生

接種到培養基上5～7d，葉柄近軸端切口處略微膨大變白；13～15d，在葉柄的近軸端出現微量愈傷組織并可觀察到芽點；21-30d，芽點逐漸長大伸長：30-45d前期未分化的愈傷組織不再有不定芽的出現(圖版A-F)。不定芽全部出現在葉柄的近軸端，表現出明顯的極性效應(圖版E)。

2.2基本培養基對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的影響

葉柄在3種基本培養基上再生率差異較顯著。在WPM培養基上，不定芽再生率達到最高28.3％，且不定芽生長健壯；LP培養基上，不定芽再生率為20.0％，生長較正常，但出現少量玻璃化現象，不利于之后不定芽的增殖和生根。MS培養基上不定芽再生率僅為11.7％，且不定芽發生時間較WPM和LP培養基晚3d(表1)。

2.3 激素對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的影響

由表2可知，當只添加TDZ 0.5mg·L^-1時，葉柄再生不定芽效果最好，再生率可達28.3％，且不定芽生長健壯。當只添加TDZ 1.0 mg·L^-1。時，葉柄不定芽再生率雖然可達31.7％，但出現玻璃化現象。不利于之后不定芽的增殖和生根。從處理1-5不定芽的再生率及生長狀態可以看出，隨著TDZ濃度的增加，不定芽的再生率先增加后降低，且不定芽隨著TDZ濃度的增加出現玻璃化現象并逐漸加重。在25個處理中，隨著2，4-D濃度的增加，不定芽的再生率逐漸下降。當2，4-D濃度為0mg·L^-1時，葉柄不定芽的再生率達到最高；而當2，4-D濃度達到0.8mg·L^-1。時，葉柄不能再生不定芽，說明2，4-D對中國李葉柄不定芽的再生有抑制作用。

2.4 暗培養時間對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的影響

將葉柄接種在誘導不定芽再生的適宜培養基WMP+TDZ0.5mg·L^-1上，發現暗培養時間對不定芽再生影響顯著。葉柄經過14 d暗培養后再轉入光下培養明顯促進不定芽的再生，再生率為30.0％，且不定芽生長健壯；而未經過暗培養的葉柄短時間內全部褐變，再生率為0(表3)。

2.5 瓊脂濃度對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的影響

瓊脂濃度對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的再生率影響并不顯著，但對植株的生長狀態影響較為明顯。同樣接種在WMP+TDZ 0.5mg·L^-1。固體培養基上，當瓊脂濃度為6g·L^-1時，不定芽的再生率為35.0％，且不定芽生長健壯。隨著瓊脂濃度的降低，不定芽易出現玻璃化現象；而瓊脂濃度增加，培養基固化程度較重，不定芽發生時間延后(表4)。

2.6 不定芽的增殖、生根和成苗

當不定芽生長到1.5cm長的時候，將不定芽從葉柄上分離后繼代培養1-2次。從繼代培養的試管苗中選取長約1.5cm的帶有2-3片葉的新梢，接種到生根培養基上。接種后暗培養7d，然后移至光下培養。2-3周試管苗生根，生根率在85％以上，每株生根3-4條。之后煉苗1周就可移栽進營養缽中繼-續生長培養(圖版-G~I)。

3 討論

3.1 基本培養基對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的影響

目前，核果類果樹中應用比較廣泛的是MS培養基，但也有試驗表明F14培養基更適合核果類果樹組織培養。Fasolo等引認為，低鹽培養基比高鹽培養基效果更好，尤其是較低質量分數的N素對以葉片為主的外植體不定芽再生效果較好。Barbara等指出，歐洲李葉片在含氮量等同于1/2MS總氮量的培養基上再生率顯著高于MS培養基。本實驗比較了WPM、MS、12等基本培養基誘導中國李葉柄不定芽再生的效果，發現WPM培養基對中國李效果最好，新梢生長正常，LP次之，MS最差。這與櫻桃葉片再生、中國李葉片愈傷組織誘導、櫻桃李葉片再生等研究中得到的結論相同。這可能是因為WPM培養基中各類礦物質成分偏低，N含量低，Ca含量高，屬于低氮、低鹽培養基，更有利于李屬植物的生長。

3.2 植物激素濃度配比對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的影響

植物激素對愈傷組織誘導、器官分化起著重要作用，是影響物質形態建成的主要因子。當生長素與細胞分裂素比值低時有利于長芽，比值高時有利于長根，中間比值有利于愈傷組織的誘導和分化。TDZ作為一種細胞分裂素，對木本植物的離體芽增殖具有顯著的促進作用。近年來，TDZ廣泛應用于核果類果樹葉片培養，Mante等用5-12.5umTDZ誘導歐洲李子葉，獲得了再生芽。Barbara等研究表明，適宜濃度的TDZ可以促進葉片產生大量的愈傷組織及不定芽，而BAP只能使葉片產生少量的愈傷組織和單一的芽。Canli等單獨使用TDZ誘導日本李子葉，獲得了再生芽，同時指出TDZ誘導不定芽的效果優于6-BA。本試驗中，TDZ對葉柄再生起到了很好的效果，但隨著TDZ濃度增高，玻璃化和簇狀苗現象增多，這可能是由于它極高的細胞分裂素活性造成的。因此適當的添加TDZ，有利于中國李Nubiana葉柄不定芽的發生。

3.3 暗培養時間對中國李Nubiana離體葉柄誘導不定芽的影響

大量研究顯示，光照條件是影響植株不定芽再生的重要因素之一。Liu等認為接種后最初的暗培養是再生過程所必需的，而且光照的抑制作用不可逆轉。本試驗研究結果表明，不經過暗培養的葉柄不能再生不定芽，最佳的暗培養時間為14d。這與歐洲李、野生櫻桃李上的研究結果相似，但由于試驗材料基因型的不同，最佳暗培養時間也有所不同。同時研究發現，暗培養時間的長短對不定芽的發生有顯著影響。暗培養時間短，不能啟動葉柄不定芽的發生；而暗培養時間長，所發生的不定芽因得不到光照白化死亡，愈傷組織大量生長，且不再具有分化能力。因此，適宜的暗培養時間有利于中國李Nubiana不定芽的發生。

樊青峰等利用中國李Nubiana葉片誘導出愈傷組織，但所得愈傷組織未進一步分化形成再生植株。本試驗以中國李Nubiana葉柄為外植體，誘導出愈傷組織進而產生不定芽，但再生率不高，仍需進一步提高，以期滿足中國李遺傳轉化對再生體系的要求。

4 結論

中國李Nubiana葉柄再生不定芽最佳培養基為WPM+TDZ0.5mgL^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂6g·L^-1，不定芽再生率可達到35，0％。暗培養是中國李Nu。biana葉柄再生的必要條件。在最佳培養基上，葉柄暗培養14 d，不定芽的再生率最高。