板栗CmMYB轉錄因子基因的克隆及在花序發育中的表達分析

摘 要：板栗大量雄花序影響產量形成，寡雄性狀是板栗重要的育種目標。利用RT-PcR與RACE擴增方法，從板栗極短雄花序芽變和正常雄花序cDNA中分離出一個板栗MYB轉錄因子cDNA全長，進行測序和序列分析。結果表明，克隆的cDNA片段總長為1522bp，基因內部含有完整的開放閱讀框架，大小為1071bp，可編碼長度為357個氨基酸殘基的蛋白質，所推導的蛋白質氨基酸序列與蘋果的MyB91、豌豆的MYB轉錄因子和蒺藜苜蓿的

關鍵詞：板栗；雄花序；MYB轉錄因子；熒光定量PCR

中圖分類號：S664.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)05-713-06

板栗雄花序為圓柱狀菜荑花序，正常的雄雌花比例為24D0～4000:1左右，雄花量極大，其消耗樹體貯存營養的20％～40％，是造成板栗低產的重要原因之一。選育雌花多，雄花數量少、雄花序退化或早期脫落的豐產優質品種便成為板栗育種的一個目標。1995年在北京市密云縣板栗產區發現1株雄花序短縮的變異類型，主要表現為雄花序短小，平均長度僅有2.2cm，其雄花序在生長發育進程中，花序頂端由變黃到彎曲至脫落死亡，基部留下的花序短小，雄花簇和花粉發育與對照無差異。通過對短雄花序發育中上部自然衰落的異常死亡現象研究，證明該異常由細胞程序性死亡而致。課題組前期預試驗對板栗雄花序進行不同濃度的外源激素(赤霉素、生長素、脫落酸、乙烯、蕓苔素和細胞分裂素)處理，發現只有經過高濃度赤霉素處理的芽變短雄花序恢復生長，說明赤霉素含量降低可能誘導發生細胞程序性死亡而引起板栗雄花序的短縮。

轉錄水平的調控是基因表達調控的重要方式，轉錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區順式作用元件(cis-acfing factor)特異性結合的DNA結合蛋白。它通過與靶基因的互作以及和其他相關蛋白的聯系來調節基因表達的強度，應答激素刺激和外界環境脅迫，或控制基因的時空特異性表達。根據DNA結合功能域的結構，轉錄因子可分為數個典型的轉錄因子家族，MYB轉錄因子家族即為其中之一。MYB轉錄因子家族成員以含有MYB結構域為共同特征，按所含MYB結構域的數目，MYB類轉錄因子可分成3種類型，即分別含1個、2個和3個MYB結構域。植物中絕大多數MYB轉錄因子都只含有2個MYB結構域，稱為R2R3-MYB蛋白。R2R3-MYB基因廣泛參與植物各種生理調節過程，如參與植物次生代謝的調節；參與對環境脅迫，光和激素的應答；參與植物特有器官的形成，如調節根毛、氣孔、表皮毛表皮細胞的特化，調節葉片的形態建成等。最近，Aya等通過對水稻的GA缺陷型、GA不敏感型和GAMYB突變體研究發現，GAMYB能夠直接激活GA調控代謝中的一個脂代謝基因CYP703A3，從而調控花粉粒外壁發育和花藥絨氈層細胞的程序性死亡。Kaneko等研究發現大麥GAMYB在花器官發育和花粉發育過程中起著重要的作用。所以我們以板栗正常雄花序和芽變短雄花序為試材，擬克隆獲得板栗與赤霉素相關MYB轉錄因子基因，并對其基因及其編碼蛋白序列進行分析，同時，采用實時熒光定量PCR技術對不同時期的基因表達量進行檢測和分析，研究板栗MYB轉錄因子的調控作用，為芽變板栗短雄花序分子機理研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試材為板栗(Castartea mollissima B，1)正常雄花序和芽變短雄花序，源于北京市密云板栗產區。從2008年5月3日花序萌發開始，到5月27日花藥萌發為止，按照板栗雄花序不同發育時期，共采樣6次，3次重復。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(北京博邁德科技發展有限公司)提取正常雄花序的總RNA，利用Clonteeh SMARTTMLibrary試劑盒(購自Clontech)合成3-RACE和5-RACE cDNA第一鏈。

1.3 板栗MYB轉錄因子基因序列的克隆

根據GenBank中公布的蘋果(DQ074473.1)、擬南芥(AFl75996.1)、硬粒小麥(AB214883.1)等植物與赤霉素相關的MYB轉錄因子序列的保守區域設計兩對兼并引物MYB—s1：GAMACATGRT—SARGGAAACG，MYB-al：TGACWASGAKCCACCGTCT和MYB-a2：TGAMGAAKTGRCGTAGAGGT，以正常雄花序反轉錄的第一鏈eDNA為模板，以MYB-s1和MYB-al為引物進行PCR擴增。用所得到的產物為模板，以MYB-sl、MYB-a2為引物進行巢式PCR擴增，PCR產物經回收、純化，與PMDl9-TVector(購自寶生物工程有限公司)連接，轉化DH5c感受態細胞，藍白斑篩選后測序(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

利用得到的主要片段分別設計3’和5’端引物：MYBL：GAAGT]?GGCTGAACAATGGA，MYBR：GCC—CATCTGCTCAAGAAACT，UPM通用引物由RACE試劑盒提供，根據試劑盒說明，轉錄產物的3’末端用MYBL和UPM引物擴增，其PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2ml‘n，32個循環；72℃延伸10min。轉錄產物的5’末端使用MYBR和UPM引物擴增，其PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s。72℃延伸2 min，32個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經回收、純化，與PMDl9-TVector(購自寶生物工程有限公司)連接，轉化DH5a感受態細胞，藍白斑篩選后測序(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.4 核酸與氨基酸的序列分析及進化分析

用DNAMAN5.2.2軟件拼接以上序列得到板栗MYB轉錄因子基因全長cDNA序列。根據測得的核酸序列，由ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析MYB基因的開放讀碼框；利用BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行序列相似性分析；蛋白質結構的綜合預測采用CPHmodels2.0 Server在線分析和SMART在線分析。采用MEGA4.0進行蛋白序列比對和進化樹構建，進行聚類分析。

1.5 實時熒光定量PCR分析

從芽變枝與正常枝同時采集雄花序，對采集的6個不同發育時期的花序分別提取RNA，使用M-MuLV First eDNA Synthesis Kit(購自上海生物工程技術服務有限公司)合成第一鏈cDNA，按照SYBRPremix ExTaq試劑盒(購自寶生物工程有限公司)操作指導，采用實時熒光定量PCR(Real-time quanti-tative PCR，RT-qPCR)的方法，檢測基因的相對表達量。為避免DNA污染設計了跨內含子引物，MYB-s3：5-AAGAGGACGCTTrGTFAC-3：MYB-a3：5-ATTTGT?GCCGTGTTTGG-3，產物長度為213 bp。以aetin(ev253704)為內參基因設計引物，As:5-TTGACTATGAGCAGGAACTI\"-3：Aa：5-TTGTAG-GTGGTCTCGTGAAT-3，產物長度為178 bp。對反轉

2 結果與分析

2.1 MYB基因的克隆與序列比較

以正常雄花序RNA反轉錄的第一鏈eDNA為模板，擴增出一條298bp的單一特異性條帶?；厥占兓a物后經測序和序列同源性比較表明，該片段與蘋果(DQ074473.1)的MYB91，楊樹(XM_002309024.1)的MYB224基因分別具有82％和79％的氨基酸序列同１源性，證明該擴增產物是MYB基因片段，這為進一步通過RACE法克隆MYB基因全長序列提供了前提條件。

根據5’-RACE和3’-RACE測序結果拼接出板栗MYB基因，序列全長為1522bp。對該基因序列進行分析表明，其含有一個編碼357個氨基酸的完整閱讀框架，包括起始密碼子和終止密碼子。利用DNAMAN5，2.2軟件，對MYB基因編碼的氨基酸序列分析，認為該基因具有完整的5’和3’末端，是板栗MYB基因的全長序列(圖1)。命名為CmMYB(GenBank登錄號為GU076490)。

2.2 CmMYB基因編碼產物的功能分析比較與同源性比較

將得到的CmMYB基因序列進行BLASTX分析，發現與GenBank中蘋果(Malus×domestica)的MYB91氨基酸序列相似性為88％、豌豆(Pisumsativum)的MYB轉錄因子氨基酸序列相似性為87％、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的MYB轉錄因子氨基酸相似度為87％。利用CPHmodels 2.0Server分析得到的CmMYB轉錄因子的空間結構進行預測，發現其具有兩個典型的螺旋一轉角一螺旋一轉角一螺旋結構(圖2)?？梢詳喽寺〉玫降腸DNA序列為典型的植物R2R3MYB轉錄因子。經分析氨基酸序列C端富含酸性氨基酸及絲氨酸，推測具有轉錄激活功能。雄蕊原基形成期和花藥形成期六個時期進行基因相對表達量的檢測。

根據http://www.expasy.org/ools/pi_t001.html在線軟件對編碼氨基酸分子量和等電點進行分析得到CmMYB分子量約為41ku，預測PI值為9.50。根據SMART和BLAST在線對編碼蛋白的結構域和功能位點進行分析表明，氨基酸序列3-55位點、58-106為兩個MYB結構域，是DNA結合功能域。

基于擬南芥的119個MYB轉錄因子與Cm-MYB的氨基酸序列，采用MEGA4，0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構建進化樹，建樹模型選用Pois-SOIl correction距離法(圖3)，并進行1000次置信度檢驗。由圖可看出CmMYB與AtMYB91同源關系很近，推測其功能也與之相近。

2.3 CmMYB在不同時期的表達量分析

采用實時熒光定量PCR方法，對從芽變枝與正常枝同時采集的雄花序，分為雄花序原基形成期、花簇原基形成期、花朵原基形成期、花被原基形成期、

由iCycleriOTM自動測出的板栗屬內參基因actin的回歸方程、PCR擴增效率和相關系數分別為：Y=-3.4478X+34.269、105.3％和0.999’；測出的Cm-MYB的回歸方程、PCR擴增效率和相關系數分別為：Y=-2.9421X+32.776、110.7％和0.998。說明該試驗具有良好的重復性和較高擴增效率。熔點曲線分析出的actin和CmMYB均只有1個Tm值，分別為85℃和82.5℃，表明actin和CmMYB所用引物具有高度特異性，其PCR擴增產物均為目的片段，不含引物二聚體。

CmMYB基因在不同時期的正常雄花序和芽變雄花序中表達模式如圖4。把表達量最高的花簇原基形成期正常雄花序中的表達量定為“1”，按照相對定量公式2作圖。由圖4可以看出，在板栗雄花序生長發育的雄花序原基形成期、花簇原基形成期、花朵原基形成期、雄蕊原基形成期和花藥形成期芽變雄花序中的CmMYB基因的表達量均低于正常雄花序；在花被原基形成期，CraMYB在芽變雄花序中表達量遠遠高于正常中表達量，此時期芽變雄花序上部枯黃，開始發生彎曲現象。

3 討論

通過轉錄因子在轉錄水平上調控目的基因表達是植物對其生長發育及生理代謝調控的一種重要方式。MYB轉錄因子是一類廣泛存在的含有MYB結構域的一類轉錄因子，參與植物各種各樣的功能。R2R3類MYB轉錄因子在植物體內主要參與次生代謝的調節和控制細胞的形態發生。Suo等㈣從棉花中分離的GhMYB09基因，編碼的R2R3轉錄因子在棉花纖維胚細胞和伸長細胞中特異表達，并指出該基因對棉花纖維的發生與伸長生長具有直接作用。擬南芥超表達AtMYB24基因會導致植株矮小且花器官發育不良，花藥不開裂，花粉無活性㈣。AYAK等”發現的水稻GAMYB能夠直接激活GA調控代謝中的一個脂代謝基因CYP703A3，從而調控花粉粒外壁發育和花藥絨氈層細胞的程序性死亡。

張婧認為板栗雄花序發育分為雄花序原基形成期、花簇原基形成期、花朵原基形成期、花被原基形成期、雄蕊原基形成期和花藥形成期，通過電鏡觀察和TUNEL原位檢測到芽變短雄花序內部細胞程序性死亡發生于花被原基形成期，從而導致雄花序的短縮。從本試驗熒光定量結果來看，在5月19正是細胞程序性死亡的花被原基形成期，該轉錄因子在芽變雄花序和正常雄花序中的表達規律與其他時期出現明顯差異，序列分析推測該轉錄因子具有轉錄激活功能，因此初步推測在芽變短雄花序發育過程中，CmMYB轉錄因子所調控的主基因在花被原基形成期大量表達與芽變雄花序上部的程序性死亡存在著某種聯系。MYB轉錄因子參與植物次生代謝調控、激素和環境因子的應答，并對細胞分化、細胞周期、器官的形成以及植物葉片的形態建成具有重要的調節作用，目前與GA相關的MYB轉錄因子中，研究比較多的是GAMYB，它能夠結合到α－淀粉酶基因的GA響應元件GARE上，隨著GA的變化來正向調節α-淀粉酶基因的表達。進化樹聚類結果顯示CraMYB轉錄因子與AtMYB91同源關系很近，而AtMYB91參與細胞正常分化，調整葉子形態。但是，CmMYB是否參與細胞正常分化與形態構成，是否與外源激素GA的調控存在具體關系，還有待進一步深入研究。