人小涎腺成纖維樣單克隆細胞的成骨分化

[摘要]目的:探索人小涎腺成纖維樣單克隆細胞的體外培養(yǎng)、擴增方法，鑒定其性質(zhì)，研究向成骨細胞分化的潛能。方法:組織塊貼壁法原代培養(yǎng)人小涎腺細胞，收集成纖維樣細胞，用96孔板稀釋鋪板法克隆培養(yǎng)，免疫熒光和RT-PCR檢測細胞表型，并進行成骨誘導分化，通過骨鈣素、一型膠原免疫細胞化學染色及堿性磷酸酶、茜素紅鈣結節(jié)染色鑒定成骨分化。結果:成功的在體外擴增培養(yǎng)出人小涎腺成纖維樣單克隆細胞，免疫熒光證實細胞表達CD13、CD29、CD106和CD44，RT-PCR顯示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表達與人骨髓間充質(zhì)干細胞相似。成骨誘導8天后，堿性磷酸酶表達陽性率100%，19天后骨鈣素和一型膠原大量表達，并形成鈣結節(jié)。結論:所建立的分離培養(yǎng)體系能夠獲得大量人小涎腺成纖維樣單克隆細胞，免疫表型類似于間充質(zhì)干細胞。在成骨誘導培養(yǎng)條件下具有良好的向成骨細胞分化的潛能。

[關鍵詞]小涎腺;單克隆培養(yǎng);成骨誘導;組織工程骨

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)04-0523-04

Osteogenic differentiation of human small salivary gland fibroblast-like monoclonal cells

DU Ming-juan， ZHAO Zhen-min， YAN Li， YIN Ning-bei， SONG Tao， LI Hai-dong

(Plastic Surgery Hospital， Peking Union Medical College， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking 100144， China)

Abstract:ObjectiveExplore the method of culturing and proliferating human small salivary gland fibroblast-like monoclonal cells in vitro， identify the character of the cells and study the potential of osteoblast differentiation.MethodsHuman small salivary gland cells was primary cultured using tissue adherent method， we collect the fibroblast-like cells and clonal culture them using 96-well plates dilution decking method， and detect cell phenotype by immunofluorescence and RT-PCR. Then we start osteogenic inducing， and identify osteogenic differentiation through osteocalcin， collagen typeⅠimmunocytochemistry staining and alkaline phosphatase(AKP)， alizarin red staining.ResultsWe successfully amplify human small salivary gland fibroblast-like monoclonal cells in vitro， these cells express CD13， CD29， CD106 and CD44 proved by immunofluorescence， and express gene CK18， α-SMA， vimentin， CD106， nestin revealed by RT-PCR similar to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. After 8 days of osteogenic differentiation， the positive expression rate of AKP is 100%， after 19 days the expressive number of osteocalcin and collagen typeⅠis large， and there are many calcium nodules formation.ConclusionWe can harvest a large number of human small gland fibroblast-like monoclonal cells through the isolation and culture system that we built， their immune phenotype is similar to mesenchymal stem cells， and they have good osteogenic potential in osteogenic induction culture conditions.

Key words: small salivary gland; monoclonal culture; osteogenic induction; bone tissue engineering

組織工程和干細胞治療為骨缺損等骨組織疾病的治療帶來新的希望。種子細胞的來源是根本問題，目前多數(shù)研究主要是以骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞為種子細胞。近年來，已有文獻報道人的腮腺存在間充質(zhì)干細胞[1]，小涎腺與其組織結構和細胞成分類似，可能同樣含有此種干細胞，而且小涎腺廣泛分布于口腔粘膜下，取材方便，來源豐富。本實驗用單克隆培養(yǎng)技術成功擴增培養(yǎng)人小涎腺成纖維樣單克隆細胞，免疫表型類似間充質(zhì)干細胞，并證實其具有良好的成骨分化潛能，可能成為新的種子細胞。

1材料和方法

1.1 材料:小涎腺來源于臨床上3例唇腭裂患者(術中暴露于上唇粘膜切口的需要去除的小涎腺)，年齡分別為3個月、 6歲和21歲，患者無腺體相關疾病和自身免疫性疾病史。

1.2 主要試劑:DMEM-F12、DMEM(LG)(Hyclone)，胎牛血清(Gibico)，0.25%胰蛋白酶、青/鏈霉素、牛胰島素、地塞米松、鐵傳遞蛋白、維生素C、β-甘油磷酸鈉均購于Sigma公司，Hu EGF和HGF購于PeproTech公司，即用型SABC免疫組化染色試劑盒、即用型Cy3/FITC免疫熒光染色試劑盒和兔抗人CD29、CD13、CD106、CD44抗體購自博士德，茜素紅粉劑(優(yōu)博奧)，BM Purple(Roche)，兔抗人一型膠原和骨鈣素(博奧森)，TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(北京六合通)。

1.3 原代培養(yǎng):取唇裂患者術中暴露于上唇粘膜切口內(nèi)需要切除廢棄的含小涎腺的組織，去除多余的結締組織，分離得到完整的小涎腺，滴少量培養(yǎng)基以保持組織塊濕潤，用眼科剪將其剪成大約1mm3的碎塊，均勻的鋪于培養(yǎng)瓶底部，間距平均5mm，加好培養(yǎng)基后豎立放于培養(yǎng)箱中，4h后放倒使組織塊完全浸在培養(yǎng)液中，4天后首次觀察換液，以后每3天換一次液。原代培養(yǎng)10～14天。

培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基:DMEM-F12 1:1，10%胎牛血清，1%青/鏈霉素。

1.4 克隆培養(yǎng)方法(96孔板稀釋鋪板法):組織塊貼壁法長出的原代細胞用0.25%胰酶37°C消化1min，獲得成纖維樣細胞，計數(shù)，稀釋至10個細胞/ml，以100μl/孔接種于96孔板，過夜貼壁后，鏡下觀察，挑選出只有1個細胞的孔，待細胞80%融合后依次傳代至24孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板和25cm2培養(yǎng)瓶。

克隆培養(yǎng)基: DMEM/F12 1:1，10%胎牛血清，牛胰島素5μg/ml，地塞米松 10-7mol/L，鐵傳遞蛋白5μg/ml，Hu EGF 20ng/ml，HGF 50ng/ml。

1.5 鑒定克隆細胞:每例患者隨機選取三個克隆，分別用CD13、CD29、CD44、CD106抗體進行免疫熒光染色，檢測克隆細胞的免疫表型。

分別提取上述9組單克隆細胞的RNA，測定樣品在260nm的吸收值確定RNA的純度和濃度。RT-PCR檢測CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因在人小涎腺成纖維樣克隆細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達，比較差異。RT-PCR使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0。

實驗步驟均按試劑盒說明書操作。檢測基因的引物、大小和退火溫度見表1。

1.6 成骨誘導分化及鑒定:成骨誘導:將克隆細胞接種于預置玻片的35mm培養(yǎng)皿，待長到70%～80%融合時換成骨誘導培養(yǎng)基，每3天換液一次。成骨誘導培養(yǎng)基:DMEM(LG)，10%胎牛血清，1%青/鏈霉素，0.1μM地塞米松，維生素C50μM，β-甘油磷酸鈉10mM。

分別在誘導的第0、8、19天固定預置的細胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，①堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)染色，使用BM-purple染液，觀察陽性細胞比例;②Dah1 McGec-Russell氏茜素紅染色，觀察能否及何時形成鈣結節(jié);③一型膠原和骨鈣素SABC免疫細胞化學染色，DAB顯色。

1.7 陰性對照:所有培養(yǎng)步驟相同，但用完全培養(yǎng)基代替成骨誘導液。

2結果

2.1 細胞生長增殖情況:分離得到的小涎腺，成人約一到兩個可接種于一個25cm2培養(yǎng)瓶，兒童和嬰兒約需要三個。接種后4～5天開始有細胞爬出，有的為上皮樣，也有的為成纖維樣。經(jīng)過原代培養(yǎng)10～14天左右傳第一代，0.25%胰酶37℃消化1min，成纖維樣的細胞基本全部消掉，而上皮樣細胞很難消掉。本實驗研究對象即為成纖維樣的細胞。

每例患者原代細胞接種于1個96孔板，三例獲得單個細胞孔分別為6、7、8個，最終共獲得13個克隆。用克隆培養(yǎng)基培養(yǎng)的單克隆細胞一直保持原有的細胞形態(tài)，多呈細長的成纖維細胞樣，但不同克隆間存在微小差異，有的相對短小。

細胞增殖能力強，從96孔板1個細胞擴增到25cm2培養(yǎng)瓶3.9×105～1.1×106個細胞，平均需要21.6天時間，倍增了18～20次。

2.2 克隆細胞免疫表型類似于間充質(zhì)干細胞:不同克隆的免疫熒光染色證實克隆細胞均表達CD29、CD13、CD44這些公認的間充質(zhì)干細胞標記，雖然不同克隆表達CD106熒光強弱不一，但均為陽性，見圖1。

RT-PCR結果顯示人小涎腺成纖維樣克隆細胞表達CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因與骨髓間充質(zhì)干細胞類似，見圖2。

2.3 成骨分化:形態(tài)學改變:換成骨誘導液后，皿內(nèi)細胞體積變大，形態(tài)為多邊形，核仁清晰，細胞內(nèi)顆粒增多，隨時間延長有些形成小球樣結構，有些呈克隆樣，中間隆起形成立體結構。

通過堿性磷酸酶、骨鈣素、一型膠原和鈣結節(jié)的表達情況來鑒定成骨分化。

2.3.1 堿性磷酸酶染色:誘導第0天，有少量的堿性磷酸酶染色陽性細胞，隨后其表達逐漸增多，到第8天，所有細胞均為陽性，至第19天表達量仍繼續(xù)增加。陽性表現(xiàn)為細胞內(nèi)外的藍色顆粒，見圖3(AKP 0、8、19天)。

2.3.2 骨鈣素和一型膠原免疫細胞化學檢測:誘導的第0天，二者均沒有表達，第8天僅有少量骨鈣素表達，至第19天，兩者均大量表達，尤其在細胞克隆樣生長的中央，結節(jié)樣，呈棕黃色，見圖4(骨鈣素0、8、19天)，圖5(一型膠原8、19天)。

2.3.3茜素紅染色:鈣結節(jié)出現(xiàn)在誘導兩周以后，呈鮮艷紅色，見圖6。

2.4 陰性對照:對照組有堿性磷酸酶的部分表達，第19天有少量的骨鈣素表達陽性細胞，其他標記物陰性。

3討論

種子細胞是組織工程的關鍵環(huán)節(jié)之一。骨組織工程理想的種子細胞來源應具備下列特點:①取材容易，對機體的損傷小;②在體外培養(yǎng)中易定向分化為成骨細胞和具有較強的傳代繁殖能力;③植入機體后能適應受區(qū)的環(huán)境并保持成骨活性[2]。當前成骨細胞主要來源于骨、骨外膜、骨髓和骨外組織。骨與骨膜來源的種子細胞在體外較易定向分化為成骨細胞， 培養(yǎng)也較容易， 但取材困難， 每次獲取均會造成新的創(chuàng)傷，獲得的細胞數(shù)量也有限。骨髓來源雖然相對充足、取材方便、成骨能力確切，但其本身數(shù)量有限，并且隨年齡增長骨髓基質(zhì)細胞會不斷減少。

骨外來源的種子細胞成為新的研究熱點。已有文獻報道人的腮腺存在成纖維樣的間充質(zhì)干細胞，能夠在體外誘導分化為成骨、脂肪和軟骨細胞[1]。小涎腺與大唾液腺組織結構和細胞成分類似，可能同樣含有此種干細胞，具有分化為成骨細胞的潛能。小涎腺相對于其他種子細胞其資源豐富，廣泛分布于口腔粘膜下;取材方便，位置表淺僅需局麻;創(chuàng)傷微小，不留瘢痕。

我們建立的培養(yǎng)體系能夠從很少量的小涎腺中分離培養(yǎng)出大量成纖維樣的單克隆細胞，細胞系得到純化，得到的細胞增殖能強，經(jīng)過長時間培養(yǎng)和多次傳代后細胞仍保持良好的狀態(tài)和增殖活性，可大量擴增。

CD29、CD13、CD44已被公認為人間充質(zhì)干細胞標記[3]，CD106在人骨髓間充質(zhì)干細胞陽性表達[4]。小涎腺成纖維樣克隆細胞均表達這些標志物并與骨髓間充質(zhì)干細胞的CD106、α-SMA[4]、vimentin[5]、nestin[6]、CK18[7]基因表達相似。這些都說明其免疫表型與間充質(zhì)干細胞類似。

本試驗用簡單的化學誘導方法，即體外培養(yǎng)時加入適量地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉這些成骨添加劑[8]，即可使克隆細胞向成骨細胞分化。成骨誘導開始后堿性磷酸酶表達迅速增加，至第8天全部細胞均為陽性，隨后仍繼續(xù)增加。堿性磷酸酶是一類與礦物質(zhì)形成緊密相關的蛋白質(zhì)，鈣離子在其作用下，沉積于膠原上，完成基質(zhì)礦化過程，是成骨細胞成熟的重要標志[9]。至誘導第19天，細胞克隆樣生長的中心形成很多茜素紅染色陽性的鈣結節(jié)，這些結節(jié)也表達骨鈣素和一型膠原。鈣結節(jié)和骨鈣素是成骨細胞的特征性標志。上述表現(xiàn)可證明克隆細胞在體外誘導培養(yǎng)中易向成骨細胞分化。此外，未誘導的細胞也有部分表達堿性磷酸酶，而且在第19天有少量細胞BGP表達陽性，說明這種細胞有向成骨細胞分化的傾向。

綜上所述，小涎腺成纖維樣克隆細胞有潛力成為骨組織工程新的種子細胞，為進一步的研究打下基礎。

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[收稿日期]2010-01-26[修回日期]2010-03-26

編輯/張惠娟