大鼠上頜第一磨牙正畸移動中牙周膜神經PGP9.5的表達

[摘要]目的:建立大鼠正畸牙移動模型，觀察PGP9.5在牙周膜(PDL)神經中的表達及變化，探討正畸力轉化成神經元的反應的細胞調控機制。方法:成年雄性SD大鼠25只，隨機分為5組:加力0、3、7、14、21天組，每組5只。上頜第一磨牙(URM1)施加50g近中向的拉力，按實驗期限，分別取不同組大鼠含磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊切片，進行PGP9.5免疫組化染色。鏡下觀察牙齒壓力側牙周膜神經纖維PGP9.5免疫陽性的變化情況，并進行灰度值分析、統計學方差分析和t檢驗。結果:壓力側的神經纖維的密度增加。在第7天牙槽骨表面出現類骨質的沉積;第21天根吸收陷窩處可見免疫陽性的牙周神經纖維。第3、7天牙周膜神經纖維PGP9.5的表達最強(P<0.05)，之后神經的表達開始下降，牙周膜神經密度也逐漸恢復。結論:正畸加力使大鼠牙周膜神經中PGP9.5表達增強，PGP9.5調控神經肽的合成和分泌，可能是神經元細胞調控的重要機制。牙周膜神經在調節骨細胞活性和促進類骨質的形成，以及牙根吸收和修復等過程中可能也發揮重要作用。

[關鍵詞]牙周膜神經;PGP9.5蛋白;正畸力;灰度值

[中圖分類號]R783.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)04-0555-04

The expression of PGP9.5 in the periodontal tissue during experimental orthodontic tooth movement in rats

CHEN Jiang-shan，ZOU Min

(Department of Orthodontic，Stomatology Hospital of Xi`an Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression and change of PDL nerve cell mechanoreceptor，and its cell division control during the transform from orthodontic force to the reaction of nerve cells by PGP9.5 immunohistochemistry staining following the establishment of animal model.Methods25 adult male SD rats were divided into 5 groups randomly， each group had 5 rats. Putting a mesial tensile force of about 50g on URM1，the rats were forced at 0d，3d，7d，14d，21d.Tissue blot containing the molar and its surrounding alveolar bone were obtained;PGP9.5 immunohistochemistry staining was applied to measure after fixing.The change of the PDL nerve fiber PGP9.5 expression on the pressure side were observed and analyzed by gray value analysis and Statistical analysis of variance and the t test.ResultsThe density and expression of PGP 9.5 immunoreactive nerves on the pressure side increased and achieved max especially at 3d、7d(P<0.05).ConclusionThe expression of PGP9.5 obviously increased in the the process of undergoing orthodontic force. This result further indicate periodontal nerve fibers played an important role in both initial stages of bone formation and tooth root resorption， as well as in the later regenerative processes of the PDL.

Key words:PDL nerve;PGP9.5;orthodontic force;gray scale

近年來，有關神經系統參與正畸牙移動的研究越來越受到學者們的關注。以往的研究主要是探討實驗性牙移動時神經遞質在牙周組織改建中的作用，但有關正畸力在神經元中表達的信號傳導機制并不是很明確。本研究采用免疫組化的方法，觀察在實驗性正畸牙移動過程中牙周膜神經末梢神經元內蛋白基因產物9.5(protein gene product9.5，PGP9.5)的表達情況，為進一步從分子水平探索正畸力轉化成神經元的反應的細胞調控機制提供理論依據。

1材料和方法

1.1主要試劑及儀器:PGP9.5抗體(Chemicon生物公司);SP-9001免疫組化染色試劑盒、DAB顯色盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);4%多聚甲醛固定液、10%EDTA慢脫鈣液、505E冰凍切片機(MICROM公司，德國)、Q550CW圖像信號采集與處理儀(萊卡公司，德國)、細金剛砂車針、正畸用彈力線、正畸測力計、0.25mm正畸不繡鋼結扎絲、自制手術臺、開口器、拉鉤。

1.2動物模型的建立及分組:成年健康雄性SD大鼠25只(西安交通大學動物中心提供)，體重(180±20)g，隨機分為5組:加力0(對照)、3、7、14、21天，每組5只。

本實驗采用大鼠上頜右側第一磨牙(URM1)為實驗牙。300mg/kg的計量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。麻醉后仰臥固定，用牙科高速渦輪機細金剛砂車針在上頜兩個切牙唇側及遠中和UM1近中軸角處，磨出深約0.5～1mm的固位溝。用0.25mm直徑不銹鋼正畸結扎絲將彈力線結扎在上頜切牙和UM1間，產生牽引UM1向近中移動約0.49N(50g)的拉力(如圖1)。嚴密監控大鼠的矯治器，若有損壞和脫落，及時安裝。

1.3標本的制備:分別在各組時間點將大鼠處死，取出上頜骨。置10% EDTA液中4℃下脫鈣4周。將脫鈣后的上頜骨去除多余組織，保留磨牙，入30%蔗糖24h，4℃至組織沉底。沿近遠中方向縱行切片，片厚20μm，-80℃冷凍保存。

1.4免疫組織化學染色:常規SABC染色方法，切片干燥30min后，0.01mol/L PBS(PH值7.4)沖洗3次后，經0.3%雙氧水封閉內源性過氧化物酶，正常羊血清封閉非特異性染色，滴加PGP9.5多克隆抗體，工作濃度1:2 000，37℃下孵育過夜，此后依次滴加生物素酶標記羊抗兔IgG第二抗體及鏈酶親和素-過氧化物酶復合物(SABC)各30min，DAB液顯色。脫水，透明，封片，光鏡觀察，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5圖像分析:本實驗采用光密度分析，顯色底物為DAB，染色呈棕黃色，顏色深淺反映了DAB的沉積量，即目標抗原的量。光密度即為圖像的灰度，與染色程度成反比，即蛋白表達強則標本染色強，透光弱，灰度值低;反之，則標本染色弱，透光強，灰度值高。每組SABC染色切片各一張，使用Q550CW圖像信號采集與處理儀，對每張免疫組化染色后的切片作PGP9.5分析。測量得出平均灰度值。染色強的標本透過弱，灰度值低，陽性率高;染色弱的標本透光強，灰度值高，陽性率低。

1.6統計學分析

1.6.1質量控制:為了減小測量誤差，選擇2名實驗觀察者，其學歷、資歷、技能相近，掌握圖形分析軟件的基本操作，事先未參與實驗設計。在3個月內對受檢標本進行3次測量，所有數據進行t檢驗，無統計學差異。此時選用平均值納入統計。

1.6.2數據采用數據±標準差表示，利用Spss13.0統計分析軟件對實驗數據進行統計學分析。對數據進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，方差齊時，組間兩兩比較采用t檢驗;方差不齊時，兩兩比較采用t'檢驗，P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1組織學觀察

2.1.1對照組(0天):根尖和根中1/3牙周膜內可見PGP9.5免疫陽性的神經纖維，其中一部分與牙骨質平行。在牙周膜的根尖區域，PGP9.5免疫陽性的神經纖維主要分布在血管周圍。少許牙周神經纖維延伸到牙根的表面和細胞牙骨質層(如圖2)。

2.1.2實驗組:①3天組(如圖3):與對照組相比，壓力側的神經纖維的密度增加。其中根尖壓力側近牙槽骨區可見稠密的、串珠狀的神經纖維的神經纖維無規則的排列;②7天組(如圖4):與對照組相比，壓力側的神經纖維的密度有所增加，近牙槽骨區可見沿著血管分布PGP9.5免疫陽性的神經纖維。而靠近牙骨質區，沒有看到分枝狀的神經末梢。在牙槽骨表面出現類骨質的沉積。但是在牙根吸收區或附近，并沒有發現神經纖維;③14天組(如圖5):神經密度減小，接近對照水平。根尖牙周膜的神經主要集中在靠近牙槽骨的區域。在一些區域還是可以看到透明化的牙周組織殘留，但是牙周膜神經纖維在這些透明區的附近很少發現。在牙根吸收區域內或附近，沒有出現牙周膜神經纖維;④21天組(如圖6):大鼠上頜右側第一磨牙的根吸收陷窩處可見免疫陽性的牙周神經纖維;這些神經纖維靠近細胞牙骨質層。在修復牙本質形成的區域，有免疫陽性神經局限性的萌發反應。透明化的區域已經幾乎全部消失。

2.2灰度測定:正畸加力實驗組和對照組的壓力側牙周膜PGP9.5免疫陽性的神經纖維的平均灰度值見表1。牙周膜中不同區域的神經纖維分布不相同，因為本實驗把牙周膜三等分:根頸1/3，根中1/3，根尖1/3。

統計分析結果如下:①正畸加力3天組，其根尖1/3和根中1/3區域的壓力側牙周膜PGP9.5免疫陽性的神經纖維的灰度值較對照組低，具有極顯著性差異P<0.01;②正畸加力7天組，根尖和根中1/3的平均灰度值較對照組低，具有顯著性的差異P<0.05;③正畸加力14、21天組，平均灰度值較對照組低，但沒有統計學意義P>0.05;④加力3、7天灰度值最低，加力時間越長，其灰度值逐漸增高。

3討論

大鼠屬嚙齒類動物，磨牙均為多根牙，結構與特性均類似于人的牙齒，大鼠上頜磨牙有遠中方向的生理移動，以切牙的支抗拉上頜第一磨牙近中移動時需要較大的力。以往研究認為40～60g的持續力移動效果較好[1]，所以本研究選用50g的牽引力，但有根吸收出現，可能最恰當的力需進一步研究確定。

正畸力可引起牙槽骨的生理性吸收和增生，這兩個過程的發生導致正畸牙的移動。目前已經被測出介導這種過程的生化信號包括前列腺素、神經遞質、細胞因子、白介素系列等。牙周膜中含有豐富的神經末梢，在矯治力的作用下，該神經末梢變形，向中樞或外周釋放各種神經遞質;神經遞質作用于牙周膜中相應的靶細胞，使該細胞內的第二信使水平增加，發生新細胞的生成和增殖，導致牙周膜、牙槽骨等牙周組織的改建，最終牙齒移動。以往的研究主要是探討實驗性牙移動時神經遞質在牙周組織改建中的作用。但是正畸力在神經元中表達的信號傳導機制并不是很明確。

神經元內的神經肽分泌一般機理是:在所有的真核細胞內，最終要釋放到細胞外間隙的神經肽在粗面內質網內合成。新合成的蛋白首先進入細胞內的高爾基器內，蛋白質在此經歷一系列翻譯后修飾，然后轉移到囊泡內，沿著微管被運輸到軸突終末釋放。大多數神經活性肽開始合成的并不是其最后分泌的形式，而是首先合成一種較大的無活性的神經肽前體蛋白。這種無活性的神經肽前體蛋白需水解成活性鈦等小片段。泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway)是對細胞內的蛋白質進行降解的一條途徑，它所介導的選擇性蛋白質降解，是細胞調控的重要機制。L'O pez-Avalos等[2]學者對編碼PGP9.5蛋白的cDNA進行測序并檢測了組織分布，認為PGP9.5是一種廣泛存在于神經元表達于細胞內的蛋白，是泛素C-末端水解酶(ubiquitz.in c-terminal hydrolases，UCH)的同工酶之一，可調節泛素化目標蛋白的降解速度[3]。

Vaska等[4]研究發現，實驗牙齒移動第3天時PGP9.5免疫陽性反應神經纖維表達開始增加，第7天時表達最強，2周后開始趨于恢復至正常。本實驗發現PGP9.5在牙齒移動過程中也呈現類似的時間變化規律，說明PGP9.5在牙周神經元中的表達與正畸壓力有一定關系。正畸力的機械刺激可導致PGP9.5蛋白表達的增加和神經纖維的增生。而牙周神經PGP9.5的表達在加力3、7天陽性率最高，隨之逐漸下降，這與Vaska研究結果不盡相同，推測可能是由于所采用的大鼠品系和正畸裝置不同造成的。如由于正畸加力3～7天后上頜第一磨牙開始發生近中移動，且彈力線逐漸老化，導致正畸力值也相應逐漸減少。而由于根頸1/3處牙周神經較少，因此PGP9.5表達的改變并不明顯。

結合本研究的結果和PGP9.5的生物活性，分析正畸牙移動過程中PGP9.5在正畸牙組織改建中的作用提示我們:PGP9.5的表達與牙周神經受到的正畸機械壓力相關。正畸加力后大鼠牙周神經元細胞中PGP9.5表達增強，其加快神經肽的前體蛋白水解成活性肽的速度，進而增加神經肽的分泌。因此，在正畸牙移動過程中，泛素-蛋白酶體途徑介導的細胞內神經肽前體蛋白的降解，調控神經肽的合成和分泌，可能是神經元細胞調控的重要機制。

有實驗報道，成骨細胞的細胞系在體外可表達多種神經肽的受體，這些神經肽包括CGRP等，CGRP的成骨性刺激作用、以及它對骨吸收的抑制潛能，都通過體外和體內試驗被證實[5]。有研究證實[6]:正畸加力可使牙周膜神經出現類似損傷性改變的應急反應。本研究也發現，實驗牙齒移動7天后，壓力側的神經纖維的密度有所增加，近牙槽骨區可見沿著血管分布PGP9.5免疫陽性的神經纖維。與此同時，在牙槽骨表面出現類骨質的沉積，提示成骨活性的增加。神經的新生與大部分的活性牙周組織重建是同時進行的。這就提示:牙周神經纖維在正畸牙齒移動過程中，可能在調節骨細胞活性和促進類骨質的形成中發揮一定的作用。

牙周膜神經纖維出現在牙根的表面，與牙根的吸收同時發生。本實驗也出現了這一現象:第7天和14天根吸收陷窩沒有出現神經纖維，但是在第21天，PGP9.5免疫陽性的神經纖維在每個牙根的根吸收陷窩內和附近可見。在加力21天時，根吸收陷窩內的神經分布與牙周組織再生的活性是同時出現的。有學者報道說[7]，在許多動物中機械壓力造成牙根的吸收后，類骨質和類牙骨質的物質開始修復牙根吸收的部分區域。盡管他強調牙根吸收和牙根修復之間的廣泛、系統的相互關系，但是他也發現，牙周感覺和交感神經可能也在這個過程中起到重要作用。段銀鐘等[8]等也認為外周神經參與局部牙周改建，尤其影響骨的形成。 因此，我們推測在一定的生理條件下，牙周神經纖維可能起到平衡硬組織形成細胞吸收和修復的作用，并因此為牙根表面提供一種保護作用。但是為了證實這種假說，我們有必要進行更多的實驗。

牙周膜神經纖維在正畸牙移動過程中的分布變化提示我們，牙周神經在調節骨細胞活性和促進類骨質的形成、以及牙根吸收和修復等過程中可能也發揮重要作用。

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[收稿日期]2009-12-30 [修回日期]2010-03-08

編輯/何志斌