骨組織工程常用間充質干細胞的研究進展

胚胎干細胞(ES)與間充質干細胞(MSC)一直是組織工程最為常用的種子細胞。但目前由于ES的分離獲取存在醫學倫理學的爭議，研究受到了一定的限制。而MSC，是一類具有多向分化潛能的干細胞，可來源于骨髓、脂肪、胎盤、臍血、臍靜脈內皮下層、外周血及肌肉等各種組織中，在特定條件下可向骨、軟骨、心肌、脂肪、血管內皮等間葉組織細胞轉化。具有來源廣泛、相對容易獲取、擴增表型穩定，同時避免了醫學倫理學爭議等優點而越來越受到研究者們的青睞。本文就骨組織工程常用MSC的生物學特性及基礎與臨床應用研究進展作簡要綜述。

1生物學特性分析與比較

自1995年Grane提出骨組織工程這一概念以來，經過十幾年的研究，骨組織工程在種子細胞、支架材料以及細胞-支架材料復合體等方面的研究取得了很大進展，為臨床骨缺損修復重建打下了良好的基礎。其中種子細胞的研究與應用主要集中在以下幾種間充質干細胞:骨髓間充質干細胞、臍血間充質干細胞、脂肪干細胞、肌源性干細胞等。

MSC是一類具有多向分化潛能的干細胞，可來源于骨髓、脂肪、胎盤、臍血、臍靜脈內皮下層、外周血及肌肉等各種組織中。在特定條件下可向骨、軟骨、心肌、脂肪、血管內皮等間葉組織細胞轉化。來源不同的MSCs，雖在生物學特性方面均表現干細胞特性，但相互之間仍有一定差異。目前對于MSCs的生物學特性研究主要集中在以下幾個方面:

1.1分離培養

1.1.1骨髓間充質干細胞(BMSCs):具有來源廣泛、相對容易獲取、擴增表型穩定，無醫學倫理學爭議及過大的骨異常增殖趨勢等優點，被公認為是骨組織工程最為常用的種子細胞。目前分離BMSCs的常用方法有5種:即全骨髓法、密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細胞儀法及免疫磁珠法。全骨髓法即根據干細胞貼壁特性，定期換液棄去不貼壁細胞，從而達到純化細胞的目的;密度梯度離心法是根據BMSCs與其他細胞的密度不同而采用percoll分離液將其分離出來;貼壁篩選法則是根據BMSCs具有在塑料組織培養瓶中貼壁生長的特性對其進行分離;流式細胞儀分選法則是根據BMSC體積小、相對缺少顆粒的特性對它進行分選;而免疫磁珠法則根據細胞表面帶有或缺失的抗原成分進行正選或負選，用抗體包被磁珠，獲得相對純化的細胞。其中由于經過流式或磁珠分選后的干細胞會出現增殖緩慢等一些問題，加之耗費較大和技術的難度，兩者應用并不廣泛。目前最為常用分離BMSCs的方法主要是全骨髓法和密度梯度離心法，由于單獨應用時存在獲取細胞純度不夠及數量較少等缺陷，近年有人嘗試用密度梯度離心結合貼壁篩選法分離提取骨髓間充質干細胞，效果比較理想[1]。

BMSCs一般原代培養接種3～4h后開始貼壁，24h大量貼壁;2～3天見部分集落形成，大多數細胞有胞漿突起;7～10天集落迅速增多，以梭形細胞為主，胞漿豐富、核大、核染色質細、核仁明顯，細胞呈平行排列或漩渦狀生長;14天左右融合達80%～90%，可進行傳代。傳代細胞呈均勻分布生長，細胞以梭形為主。BMSC的生長潛伏適應期為1～2天，3天后進入對數生長期，6～7天后進入生長平臺期。BMSC倍增時間為30～50h，細胞每傳一代，細胞數約增長2倍。不同物種的BMSCs特性不盡相同，不同培養基、血清濃度、細胞接種密度、換液時間、酶消化時間、培養基pH值都會影響其生長[2]。

1.1.2臍血間充質干細胞(UC-MSCs):臍帶血是臍帶內及胎盤近胎兒一側血管內的血液，含有豐富的干細胞和祖細胞，其主要包含造血干細胞(HSCs)和MSCs。與骨髓相比，臍帶血有更充足的來源;臍血的免疫原性較弱，能耐受更大程度上的HLA配型不符;移植物抗宿主病(GVHB)發生率較低;其間充質干細胞更為原始，擴增能力更強等優點，故臍血干細胞可作為一種新的替代細胞來源，用于各系統疾病的細胞移植及基因治療，它的作用也越來越受到重視[3]。

目前用于UC-MSCs分離的方法同BMSCs基本相同，但UC-MSCs的分離培養和篩選與臍血樣本的選擇、培養基的差異以及分離、篩選過程中操作技術等多種因素有關，也無統一標準。不同培養基、不同批次的血清、不同的pH值、不同接植密度都會影響細胞的生長。一般原代培養的臍帶血間充質干細胞多在培養24～48h后貼壁，1周左右成梭形，并成克隆性生長，4～5周可達80%以上的融合。原代培養的干細胞中可見多核，形態扁平的破骨樣細胞混雜，一般傳代至第3代時即可獲得純度較高且形態均一的長梭形的間充質干細胞[3]。

1.1.3脂肪間充質干細胞(ADMSCs):是指從脂肪組織抽吸物中獲得的一種成纖維細胞形態的細胞群，具有取材容易，獲得率高， 自我更新能力與多向分化潛能類似BMSCs等優勢。原代培養細胞呈平行排列，漩渦樣生長，細胞多為梭形、多角形等，胞漿和核仁豐富。傳代培養中，經過多次傳代(10～20 代)，細胞的增殖速度無明顯減慢，衰老和死亡細胞所占比例也很少。這表明脂肪組織蘊含豐富的干細胞，且細胞體外擴增能力很強，易于傳代培養[4]。由于ADMSCs來源廣泛、取材容易且分離提取方法相對簡單，形態及功能均類似BMSCs，近年來日益受到研究者的重視。

目前對于ADMSCs的提取主要采用的是酶消化法，即在無菌條件下取脂肪組織，經I型膠原酶消化后離心收集沉淀再經200目細胞篩過濾獲取目的細胞。同其他MSCs一樣，不同組織來源的脂肪、不同實驗室不同操作人員的操作技術、不同培養基、不同批次的血清、不同接種密度等也都會影響ADMSCs的生長。

1.1.4肌源性干細胞(MDSCs):骨骼肌中含有豐富的細胞成分，從原始的干細胞到終末分化的成熟細胞。近年來在骨骼肌中發現了一群被稱為MDSCs的細胞群體。研究表明，它是和被證實的骨骼肌中含有的能夠自我更新并向肌、骨以及脂肪組織細胞等分化的肌衛星細胞是完全不同的一類細胞群，可能是一群未向任何方向分化的原始干細胞。與BMSCs相比，其具有來源相當豐富、易于分離、易于誘導成骨等優點，使之得到越來越多研究者的重視，并在骨組織工程研究中被廣泛應用。目前對于MDSCs的分離，基本上同ADMSCs，同樣是在無菌條件下取特定組織塊，然后經酶消化后離心、過濾。具體操作流程與細節，由于實驗室條件、操作者水平等差異，而略有差異。而純化技術主要有三種:冷凍法、Hoechst/FACS法以及Pre-plate法。其中冷凍法與Hoechst/FACS法并不常用，而Pre-plate是利用細胞貼壁速度慢的特點，經反復貼壁培養而除去非干細胞以達到分離純化MDSCs的目的，因此有學者稱之為差速貼壁法。該方法在近年MDSCs的分離純化上逐漸得到認可并被廣泛使用[5]。原代培養MDSCs的較其他細胞貼壁較慢，一般在分離后5～6h貼壁，其體積較小，呈球形，折光性強，48h后完全貼壁，并開始增生，細胞逐漸變成橢圓形或紡錘形，進一步相互融合有規律地逐漸平行排列，7～10天時，細胞90%融合，常規消化傳代同其他干細胞[6]。

1.2細胞分化功能:MSCs是一類具有多向分化潛能的干細胞，在特定的誘導實驗條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肝細胞、骨骼肌細胞、內皮細胞等。由于來源不同，分化表型亦有一定差異。而骨組織工程常用種子干細胞在分化功能上有著統一的共性—極易誘導分化為成骨細胞。應用常規誘導培養劑:VitaminC、Beta-甘油磷酸鈉以及地塞米松，均可將它們成功誘導分化為成骨細胞。另外，隨著近年來對于細胞因子研究的深入，越來越多的細胞因子亦被發現具有明顯的促進干細胞成骨的特性，如骨形態蛋白BMP、堿性成纖維細胞因子bFGF、轉移生長因子-Beta等[7-8]。

1.3 間充質干細胞的免疫表型及鑒定:目前，認為MSCs是一個異質細胞群， 因此至今仍未發現其特異性抗原表型，且不同來源的間充質干細胞免疫表型也有不同。BMSCs表達的抗原標記主要有: SH2、SH3、CD29 、CD44、CD71、CD9、CD105、CDl06、CDl20a、CDl24、HLA-I等，而不表達其他造血細胞系的表面標記CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD117 等細胞表面抗原[9-10]。這些抗原均具有間質細胞特征，無特異性。而UCB-MSC表達的主要分子包括:①粘附分子，CD54、CD51、CD44、CD13等;②整合素家族成員，CD49b、CD49e、CD29等;③其他，CD90(Thy1)、SH2(CD105)、HLA-ABC、ASMA、SH3(CD166，ALCAM)、SH4(CD73)等。但不表達造血細胞的表面標志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD 38、CD133、CD135(Flt-3)、CD117(c-kit)、Glycophorin A等，也不表達與人白細胞抗原(HLA)識別有關的共刺激分子B7-1、B7-2及主要組織相容性復合物II類分子如HLA-DR抗原等[11]。ADMSCs在免疫表型方面則較以上兩者又有一定差異。蘇海鵬等[12]總結了體外培養的ADMSCs表達的蛋白:①粘附分子:可表達CD9、CD29、CD49d、CD54、CD102、CD106、CD166，但不表達CD56、CD50、CD11b、CD18、CD62;②分子受體:可表達透明質酸鹽(CD44)和轉鐵蛋白(CD71)的受體;③細胞外基質蛋白和糖蛋白:ADAS細胞能生成I和II型膠原、骨橋蛋白、ostenectin、Thy-1 (CD90) 和MUC-18 (CD146);④肌蛋白:能表達平滑肌細胞內的肌動蛋白和波形蛋白;⑤造血細胞標記:不表達造血細胞標志物CD14、CD31 或CD45;⑥補體調節蛋白: 確定能表達衰變加速因子(CD55)和補體蛋白;⑦組織相容性抗原: 表達類組織相容性蛋白HLA-ABC，而不表達類蛋白HLA-DR。目前，MDSCs由于取材、分離提純方法及培養環境的不同，獲得的MDSCs表面標志物也不盡相同。但Mastrogiacomo等[13]對比了MDSCs和BMSCs表面標志物，結果顯示兩者有十分相似的表達，證明兩者是性質相似的MSCs，其特點為:①干細胞標志Sca-1(+)、CD34 (+/-);②早期成肌系標志Desmin、Bcl-2、C-met表達不一致;③造血干細胞標志c-kit(-)、CD45(-)，其他CD10、CD13、CD56等標志物表達不一。

2在骨組織工程中的應用

鑒于上述間充質干細胞的生物學特性及各自優勢，它們在骨組織工程研究中的應用越來越廣泛，并在基礎實驗與臨床應用研究兩個環節都取得了可喜的成果。目前，伴隨基因工程的發展，它們在骨組織工程研究中的作用得到了更大的體現和發揮。

2.1 基礎研究:由于大塊骨缺損修復面臨的血管化難題目前還沒能得到很好解決，利用骨組織工程技術仍無法滿足臨床上形式各異的骨缺損修復需要，因而大量的基礎研究正在為解決血管化難題，盡快實現由基礎研究向臨床過渡而努力。Jian Zhou等[14]將兔的BMSCs與源于MSC的內皮細胞聯合培養于多孔beta-磷酸三鈣支架材料上構建血管化組織工程骨用以修復兔的大尺寸骨缺損。結果顯示出良好的成骨和血管化效果，不僅證明該方法修復動物大塊骨缺損行之有效，也是臨床修復大塊骨缺損很有潛力的方案。而Lei Cui等[15]利用脂肪來源的間充質干細胞復合珊瑚支架，成功修復了犬臨界尺寸(20mm×20mm)顱蓋骨的缺損。實驗在12周與24周時分別對植入犬顱蓋骨缺損處的細胞-珊瑚支架復合材料組和單純植入珊瑚材料組做三位CT及放射圖譜分析等檢測，結果顯示實驗組較對照組骨修復體積提高了3倍多，前者基本能夠達到良好修復顱蓋骨缺損的要求。另外，經Rebekka等[16]研究發現UC-MSCs同BMSCs不僅在生物學特性方面有很多相似特性，與三維膠原支架復合培養實驗中，經組織學、免疫組織化學、免疫印跡分析和實時定量RT-PCR等檢測分析表明，UC-MSCs與BMSCs均展現了有效骨折愈合的所有特性。最后，雖然目前MDSCs在骨組織工程中的應用不如其他細胞廣泛，但近年來呈現明顯增長態勢。Kyung等[17]對大鼠MDSCs復合殼聚糖支架于體內成骨向分化實驗研究表明，凝膠殼聚糖支架是MDSCs粘附和增殖的理想基板，此外，細胞聯合殼聚糖支架實驗組植入體內后不光免疫反應較單純植入支架組低很多以外，骨形成也被證實只存在于帶MDSCs與骨誘導因子的凝膠殼聚糖支架材料中。

2.2 臨床應用:盡管目前骨組織工程技術還沒有廣泛應用于臨床，但近年來國內外報道的骨缺損修復臨床成功病例已越來越多。其中骨髓間充質干細胞應用最早且最為常見，脂肪間充質干細胞近年來也有報道，而臍血間充質干細胞及肌源性干細胞則鮮有報道，目前還主要集中在細胞自身研究及動物基礎研究階段。Marcacci等[18]將人的BMSCs復合多孔羥基磷灰石陶瓷生物材料構建與臨床患者骨缺損尺寸大小相當的組織工程骨，然后利用外科手段植入臨床骨缺損處。手術早期患者無大的并發癥及其他癥狀，手術部位亦無明顯疼痛、腫脹及感染等現象，移植物在植入5～7個月時與宿主骨完全融合，跟蹤調查6～7年骨結合良好且未發生遲發型骨折。最終結果證實利用骨組織工程技術能夠成功修復大尺寸臨床長骨骨缺損。Lendeckel等[19]則利用纖維蛋白凝膠包裹自體ADMSCs，然后應用兩塊可吸收板將其固定于患者顱骨缺損處，術后療程順利且3個月后經CT掃描觀察到新骨幾乎形成完整顱骨。

3 小結

間充質干細胞以其特有的優勢成為組織工程理想的種子細胞，并在骨組織工程基礎與應用研究中被廣泛應用。但骨組織工程要想真正實現血管化進而達到臨床化，對于間充質干細胞的研究仍有很長的一段路要走。MSC來源廣泛但表型卻有很大不同，是否是同種細胞，性質又有何特異性差別，目前尚不清楚;不同來源的MSC分化功能也有差異，如何準確控制其向某一特定方向轉化也無統一標準;另外，MSC的分離提純方法雖然很多，但同時也表明目前仍沒有一種最為理想的方法來獲取大量純化的MSC。種種問題都需要我們在研究中不斷地去發現、分析及解決。只有這樣，MSC的價值才能在骨組織工程研究中得到最大程度的體現，真正造福于人類。

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[收稿日期]2010-01-03 [修回日期]2010-03-15

編輯/李陽利