凍干法保存脫細胞組織工程血管支架的實驗研究

[摘要]目的:探討冷凍干燥技術長期保存脫細胞組織工程血管支架材料的可行性。方法:將制備的脫細胞組織工程血管支架預冷后置入-70℃、6.67×10-4kPa的冷凍干燥機內6 h作冷凍干燥處理。通過對冷凍干燥處理前后脫細胞血管支架材料的組織，超微結構觀察、生物力學評估、細胞毒性測定以及動物體內的組織相容性檢測，研究冷凍干燥處理對脫細胞血管支架材料生物相容性和生物力學特性的影響。結果:冷凍干燥處理對于脫細胞血管材料的生物力學及生物化學特性沒有明顯影響，處理后的材料依然具有良好的體內、外生物相容性。結論:冷凍干燥處理作為脫細胞組織工程血管支架材料的長期儲存方法是可行的。

[關鍵詞]組織工程血管;脫細胞組織工程血管支架;冷凍干燥

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)02-0218-04

Conservation of the tissue-engineered acellular vascular scaffold with freezing and drying technique

LIU Bin1， ZHANG Man-jing2， XIA Wei1， LU Kai-hua1，GUO Shu-zhong1

(Department of Plastic Surgery， Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032， Shaanxi，China 2.Department of Platic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College)

Abstract: ObjectiveTo investigate the feasibility of a freeze-drying technique preservation protocol on the acellular vascular scaffold.MethodsAcellular vascular scaffolds were treated by freezing and drying technique at -70℃(6.67×10-4kPa) for 6h，then appraised the scaffolds by histological and ultrastructural observation and evaluated its biocompatibility and biomechanics.ResultsIt was shown that the main performance indexes of the freeze-drying treated acellular scaffolds changed unremarkably in compared with the untreated ones.ConclusionFreeze-drying technique can be a good preservation protocol for tissue-engineered acellular vascular scaffold.

Key words: tissue engineering blood vessels; tissue engineered acellular vascular scaffold; freeze drying

隨著科學技術的發展，組織工程學的興起為從根本上解決血管移植物替代這一問題帶來了新的曙光。組織工程血管是組織工程學領域的產物之一，是一種新的有望徹底解決小口徑人工血管移植問題的方法。脫細胞血管基質因其具有取材方便、低免疫源性、機械性能良好等優良特性，在血管組織工程研究領域中得到了越來越廣泛的應用[1-2]， 成為該領域支架材料研究方面的一個熱點。通過前期的系列試驗研究，我們初步摸索出一種脫細胞血管支架快速制備、消毒及結構疏松化的方法。然而脫細胞血管材料制備后如何長期保存又是一個需要面臨和解決的問題，因此我們希望找到一種簡單可行的儲存技術來長期保存制備的脫細胞血管支架以達到臨床和科研上 “隨用隨取”的目的。

在本實驗研究中我們使用冷凍干燥技術處理制備的脫細胞血管支架，通過對處理后的支架材料進行組織，超微結構觀察、生物力學評估、細胞毒性測定以及動物體內的組織相容性檢測，研究冷凍干燥處理對脫細胞血管支架材料生物相容性和生物力學特性的影響，從而進一步評估冷凍干燥技術作為該材料長期儲存方法的可行性。

1材料和方法

1.1血管材料準備及脫細胞血管支架的制備:選取8～12月，體重在2～2.5kg的健康雄性大耳白兔20只，在麻醉、相對無菌條件下，取出兔股動脈，置于4℃含青霉素和鏈霉素各180mg/L的無菌PBS液中，熱缺血時間不超過15min。無菌PBS液沖洗數次去除血液雜質，銳性去除附屬結締組織和脂肪成分以及大部分血管外膜。截取長度為5cm、無明顯分支、內徑約3mm的動脈40根作為實驗材料。將所取得的30根血管材料反復凍融加超高壓處理后，置人含有15μg/ml RNase A，150μg/ml DNase I (Sigma)溶液中，沖洗48h(37℃，5%CO2環境內攪拌)，然后用PBS洗滌1天。

1.2脫細胞血管支架的凍干處理:取20根制備好的脫細胞血管支架材料，根據血管材料口徑和長度套入相應的玻璃棒上，于普通冰箱冷凍室內-4℃預冷24～48 h，然后在-80℃低溫冰箱中速凍24h，再置入-70℃、6.67×10-4 kPa的干燥冷凍機(LGJ-10C，上海)內6h作冷凍干燥處理。用包裝袋封裝后，置常溫下保存待用，并注明凍干日期、血管種類、長度及口徑，保存8周以上后使用。使用時，將血管材料由包裝袋中取出，浸泡于生理鹽水中復溫約10min，血管變軟后由玻璃棒上輕輕取下，以0.1%過氧乙酸溶液消毒。

1.3組織學觀察

1.3.1 光學顯微鏡:4%多聚甲醛分別固定經凍干-復水處理及經未凍干處理的脫細胞血管支架標本，常規石蠟包埋切片，行蘇木精伊紅(HE)染色后在光學顯微鏡下觀察。

1.3.2 掃描電鏡:3%戊二醛分別預固定經凍干-復水處理及經未凍干處理的脫細胞血管支架標本，4℃儲存送檢。標本在S-3400N型掃描電鏡下觀察。

1.4 兔血管內皮細胞的分離培養:無菌條件下取出兔胸主動脈。去除附壁血細胞，剪除外膜多余脂肪和筋膜。分別注入0.125%、0.25%胰酶和0.1%膠原酶消化液，使管腔充盈，37℃作用15、12、17min，松開一端，收集消化液; 注入含10%胎牛血清 M199培養液再次沖洗管腔;將消化液和沖洗液并800r/min，5min離心，棄上清;加M199培養液，吹打均勻制成細胞懸液，以2×105/瓶濃度，傳入25cm2培養瓶;37℃、5%CO2培養箱，每24h半定量換液;當原代培養至融合形成致密的單層細胞時即可傳代，實驗采用的細胞為第3～7代細胞。

1.5 接觸細胞毒性測定:實驗組將約3mm2 的無菌醫用粘合膜粘貼于一次性細胞培養皿中央，無菌條件下取5mm×5mm大小凍干處理后脫細胞血管基質，黏附于細胞培養皿中。作為陽性對照組，將一滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培養皿中央的脫細胞血管基質上;陰性對照組，培養皿中央醫用粘合膜粘貼未經凍干處理的脫細胞血管基質。將準備的內皮細胞懸液依次接種于上述培養皿中，CO2培養箱中(37℃，5%CO2)孵育48h后倒置熒光顯微鏡下觀察細胞與培養皿中央材料毗鄰部位的形態。

1.6羥脯氨酸含量測定:利用羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成)及多功能光度計分別測定分別測定新鮮血管及凍干處理前后脫細胞血管支架材料羥脯氨酸含量的變化。

1.7 處理前后材料的機械力學特性的測定:將新鮮血管及凍干處理前后脫細胞血管支架材料在INSTRUIN 1122生物力學測試系統(Instron Uo.USA)下行單軸拉伸試驗，測定最終抗張強度和縫合強度。

1.8 血管支架材料凍干-復水處理后體內生物相容性的初步研究:大耳白兔以戊巴比妥鈉(30～40mg/kg，iv)麻醉，取仰臥位固定于手術臺上，腹部兩側去毛，碘伏消毒，鋪巾。在腹部兩側各做2個切口，長約1cm，切開皮膚全層后以眼科剪仔細分離皮下形成一腔隙。把脫細胞血管基質及經凍干-復水處理的脫細胞血管基質分別植入皮下腔隙中，每側植入2塊材料，鋪平，縫合切口，再次以碘伏消毒切口。無壓力包扎，飼養。觀察兔全身及材料種植局部反應，并分別于術后7天、14天、21天及28天取出標本，4%多聚甲醛分別固定血管支架標本，常規石蠟包埋切片，行蘇木精伊紅 (HE)染色后在光學顯微鏡下觀察。

1.9 統計學分析:數據采用SPSS13.0軟件處理，結果以均數x±s表示， 數據以均數±標準差表示，采用方差分析比較， P <0.05為有統計學意義。

2結果

2.1形態學觀察

2.1.1 大體形態:脫細胞處理組管壁變軟塌陷，但彈性良好(圖1);經過冷凍干燥保存處理后的脫細胞血管支架形成特有的海綿狀多孔性結構(圖2);復水后脫細胞血管支架形態及大體結構完全復原(圖3)。

2.1.2 經凍干處理脫細胞血管基質的組織學觀察:經過冷凍干燥處理后的脫細胞血管支架，其管壁膠原纖維波浪狀結構均保存基本完好，同未經冷凍干燥處理的脫細胞血管支架相比，結構無明顯差異(圖4、5)。

2.1.3 超微結構觀察:經過冷凍干燥處理后的脫細胞血管支架結構較未處理前略疏松，但整體結構保持完好(圖6、7)。

2.2 接觸性材料細胞毒性:凍干處理前后的脫細胞血管材料均無細胞毒性，在材料的周圍未發現內皮細胞的接觸或者生長抑制，測試樣本周圍的內皮細胞形態正常，共培養的血管內皮細胞增殖旺盛(圖8、9)。

2.3 正常血管與凍干處理后脫細胞血管基質的膠原含量的測定:血管材料的羥脯氨酸含量各組兩兩相比無統計學意義(P>0.05)，即血管材料在上述各處理條件組中，其羥脯氨酸含量(膠原含量)與凍干處理前相比無明顯變化，見表1。

2.4 材料的機械力學特征:血管材料的最終抗張強度與縫線保留強度各組兩兩相比無統計學意義(P>0.05)，即血管材料在上述各處理條件組中基本力學特征在經凍干處理前后無明顯變化，見表2。

2.5經過凍干處理后血管支架材料體內生物相容性

2.5.1 術區情況及植入材料大體外觀:家兔腹部皮下埋植凍干處理脫細胞血管支架后，精神、食欲均良好。手術區術后第2天或第3天出現輕微紅腫，術后第4天到第5天消退，埋植處高出周圍皮面。切口均愈合良好，術后7天拆線。未發現明顯紅腫，無膿性分泌物等情況。手術后埋植脫細胞血管支架而隆起的高度隨時間的推移逐漸降低，到術后3周時已基本與周圍皮膚一致。

大體觀察:1周組材料體外可觸及、輪廓清晰、質地中、血管浸潤明顯、纖維包膜可與材料分離(圖10)。3周組材料外周包膜變薄，與支架材料結合緊密，材料表面有降解吸收現象，失去網狀狀結構。4周組材料幾乎完全被吸收，材料周圍組織無明顯壞死及感染。

2.5.2 植入材料組織學檢查:2周組未經凍干處理的脫細胞血管基質及經凍干處理的脫細胞血管基質材料HE染色鏡下僅見少量中性粒細胞浸潤(圖11、12)。3周后炎細胞數明顯下降，與其下組織分界不清，包膜和材料中有中性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞為主的炎性細胞浸潤并伴增生的成纖維細胞。4周組材料進一步吸收變薄，呈稀疏的線條狀，浸潤炎性細胞數量明顯減少。兩組材料體內反應過程基本相同，各組均未見組織壞死。植入材料大體外觀及組織學檢測結果表明，脫細胞血管基質在凍干處理前后具有良好的體內生物相容性。

3討論

傳統生物材料的保存方法主要有深低溫凍存和冷凍干燥保存兩種。對于凍干保存生物材料的生物學特性的研究國內外已不少見，但多集中在眼角膜、骨骼及皮膚等片狀材料方面。對于脫細胞血管基質支架此類管狀生物材料的生物力學和化學特性影響的研究，國內外尚無文獻報道。因此在我們的研究中將冷凍干燥技術應用到脫細胞血管支架此類管狀生物材料的保存處理中， 以評估凍干技術作為脫細胞血管支架材料長期保存方法的可行性。

真空冷凍干燥技術是將真空技術、冷凍技術和干燥技術結合起來的一種綜合性技術。其最先應用于血漿、血清、酶制劑、生物細胞、人體組織等生物制品和材料的凍干保存。早期的研究發現，部分蛋白制品通過冷凍干燥技術處理后的真空包裝可以達到在室溫下保存兩年甚至更長時間而不發生變質的良好效果[4]，從最早應用于處理生物學材料[5]，后歷經應用氟利昂-12改良處理法[6]，直到今天使用凍干同種異體骨成功修復牙周骨缺損[7]， 利用凍干技術制備多孔的組織工程支架材料[8]。凍干技術在組織保存及材料制備方面的研究走過了近六十年的發展歷程。

冷凍干燥處理對于脫細胞血管材料的生物學特性的影響是本試驗中主要的考察指標。主要包括材料的細胞毒性、生物力學以及生物相容性等。在我們的研究中，對經冷凍干燥保存處理的脫細胞血管基質材料的上述指標進行了體外和體內的測試。通過體外試驗，我們利用兔的血管內皮細胞對經冷凍干燥處理并保存后的脫細胞血管支架的接觸細胞毒性進行檢測。結果發現:經過凍干保存處理的脫細胞血管基質其材料毒性并未增加，材料周圍未內皮細胞形態正常且未發現內皮細胞的接觸或者生長抑制。由此我們可以得出:經過冷凍干燥處理并保存的脫細胞血管基質在體外具有良好的細胞生物相容性。另外在體內試驗中，我們在兔腹部皮下埋植脫細胞血管支架，通過對不同時間段取材的組織及形態學分析，初步證實了冷凍干燥處理前后，脫細胞血管支架材料都具有良好的體內生物相容性。

脫細胞血管基質的主要成分為膠原纖維，而膠原纖維的主要分解產物為羥脯胺酸。因此我們的實驗中通過測定凍干保存處理前后材料羥脯胺酸的含量，來判斷上述處理是否會破壞支架材料的膠原結構。結果發現經凍干保存處理前后的脫細胞血管支架其羥脯胺酸含量基本一致，從而證明凍干保存處理對于脫細胞血管支架的膠原結構無明顯影響。

足夠的初始強度和彈性對于組織工程血管支架的材料來說是非常重要和必需的。因此，我們在試驗中測試了凍干保存處理前后血管組織的強度和彈性，以判斷凍干處理對于脫細胞血管基質材料的主要生物力學指標的影響。體外測試的結果證實經過凍干保存的脫細胞血管支架其強度和彈性雖然出現了輕度的降低，但是這種改變不具有明顯的統計學意義。

本研究通過對凍干保存處理前后脫細胞血管支架材料生物化學與生物力學特性的檢測分析，初步證明:經過凍干保存處理的脫細胞血管材料，其細胞毒性、生物力學特征以及膠原結構與未經處理前相比沒有明顯的差異，凍干保存后的材料依然具有良好的生物相容性。因此我們認為:冷凍干燥處理作為組織工程脫細胞血管支架此類管狀生物材料的長期儲存方法是可行的。

[參考文獻]

[1]Teebken OE，Pichlmaier AM，Haverich A. Cell seeded decellularised allogeneic matrix grafts and biodegradable polydioxanone-prostheses compared with arterial autografts in a porcine model [J]. Eur J Vasc Endovasc Surg，2001，25(22):129-139.

[2]Cho SW，Park HJ， Ryu JH，et al. Vascular patches tissue-engineered with autologous bone marrow-derived cells and decellularized tissue matrices[J]. Biomaterials，2005，26(14):1915-1921.

[3]Sewell WH， Koth DR， Pate JW， et al. Review of some experiments with freeze -dried grafts[J]. Am J Surg，1956，91(3):358-361.

[4]Smith AU. Freezing and drying biological materials[J].Nature，1958，181 (4625):1694-1696.

[5]Briggs A. A new freeze-drying technique for processing biological materials [J]. Dev Biol Stand，1976，36:251-260.

[6]Hanes PJ. Bone replacement grafts for the treatment of periodontal intrabony defects [J]. Oral Maxillofac Surg Clin North Am，2007，19 (4):499-512.

[7]Shinichi Ha，Akira Ta. Fabrication of highly porous keratin sponges by freeze-drying in the presence of calcium alginate beads[J]. Materials Science and Engineering，2008，1250-1254.

[收稿日期]2009-09-16 [修回日期]2009-12-30

編輯/張惠娟