人脂肪干細胞向血管平滑肌細胞誘導分化的實驗研究

[摘要]目的:體外誘導培養人脂肪干細胞(adipose-derived stem cells， ADSCs)，觀察是否可以分化形成血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)，為構建組織工程化血管尋找新的種子細胞來源。方法:免疫磁珠法分選收集原代脂肪干細胞，加入PDGF-BB、TGF-β1誘導14天后進行檢測。結果:實驗組細胞生長呈現血管平滑肌細胞所特有的峰谷樣生長，血管平滑肌細胞特有的表面抗原標記物表達陽性。結論:脂肪干細胞定向誘導培養后，具有血管平滑肌細胞的特性，有可能成為構建組織工程化血管新的種子細胞來源。

[關鍵詞]脂肪干細胞;血管平滑肌細胞;血小板衍生生長因子;轉化生長因子β1

[中圖分類號]Q813.1 R622.4 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)02-0215-03

Experiments of adscs induced into vascular smooth muscle cells

JIANG Wei1，CAO Qiang1，WANG Ji-hua2，FENG Xing-hua1

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，School of Stomatology，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2. Department of Plastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College， Kunming 650101，Yunnan，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of ADSCs differentiating into VSMCs in vitro and to find the new source of seeding cells in constructing the tissue-engineered vessels.MethodsTo separate the cells from the original adipose stem cells by MACS and culture 14 days with PDGF-BB and TGF-β1.ResultsThe cells show \"peak and valley\" growth pattern specified as mature VSMCs and express the VSMC's markers.ConclusionADSCs were induced in vitro in specific environment，the cells show the significant characteristics of VSMCs and have the potentiality being seeding cells of construct the tissue-engineered vessels.

Key words: adipose-derived stem cells; vascular smooth muscle cells; platelet derived growth factor BB; transforming growth factor beta

脂肪干細胞由中胚層分化發育而來，具有類似于骨髓間充質干細胞的干細胞特性[1]，可以向脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞和成骨細胞分化[2]，而且脂肪干細胞取材更方便、更容易獲取。研究發現:體外培養ADSCs可表達肌源性標志物MyoD1 和肌球蛋白重鏈[3]，體內實驗也證明其表達α- 肌動蛋白[4]。本實驗觀察研究了脂肪干細胞在特定的誘導環境下，向血管平滑肌細胞分化的情況。

1材料和方法

1.1 主要試劑與儀器:FBS、M-199 培養基(Gibco公司，美國);TGF-β1(transforming growth factor， TGF-β1)、PDGF-BB(platelet derives growth factor-BB， PDGF-BB)(Sigma公司，美國);單克隆鼠抗人α平滑肌肌動蛋白(α-SMA，Dako Cytomation公司，美國);單克隆鼠抗人平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC，Chemicon公司，加拿大);單克隆鼠抗人Calponin、單克隆羊抗人SM22α(Abcam公司，美國);倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本);LSN-510 激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，德國)。

1.2 ADSCs 分離培養與傳代:脂肪組織由脂肪抽吸術獲得，37℃搖床中0.075%Ⅰ型膠原酶消化PBS清洗的脂肪，60min，加入同體積含10% FBS的M-199 培養液終止消化。300×g離心10min，去上清，100目濾網過濾，加入10%M199培養液吹打均勻接種，恒溫培養24h后PBS去除未貼壁的細胞。

1.3 免疫磁珠(MACS)細胞分選:胰酶消化法收集生長至融合的原代細胞，離心去除上清，加入5%BSA/PBS吹打均勻，200目濾網過濾后離心去除上清，加入CD34b和CD34fc，比例為100μl/108cells，4°C避光30min，加入5%BSA洗除未結合抗體，離心去除上清，加入5%BSA進行免疫磁珠分選，得到CD34+的細胞。

1.4 實驗分組:分選出的CD34+細胞生長至融合后，酶消化法收集細胞，以2×104個/cm2接種于培養皿，實驗組用加入含2.5ngTGFβ1、50 ng/ml PDGF-BB的5% M199培養液培養，對照組以5%M199培養液培養。

1.5 檢測指標

1.5.1 常規培養并隔日換培養液每日觀察細胞生長情況和形態特征變化。

1.5.2 免疫熒光檢測:培養14天后，收集兩組細胞，用乙醇及冰醋酸以99:1 比例固定15min，PBS漂洗，10%羊血清封閉30min，加入以0.1% BSA稀釋的1:100 抗體:α-SMA、SM-MHC和Calponin，4℃過夜，PBS漂洗，滴加FITC標記相應二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗，碘化丙啶襯核后，熒光顯微鏡下觀察。胞漿內綠色熒光為陽性表達，細胞核為紅色熒光。

2結果

2.1形態學:原代培養的脂肪干細胞貼壁后呈紡錘形或梭形，類成纖維細胞生長(圖1A);MACS分選獲得的脂肪干細胞生長呈紡錘形(圖1B)，誘導48h后，形態較對照組有所增大并有一定方向性(圖1C)，7天后呈現血管平滑肌細胞所特有的“峰-谷”樣生長(圖1D);對照組細胞形態呈梭形或紡錘形，類成纖維樣生長，約5～6天可生長至融合。

2.2 免疫熒光檢測(圖2):分別取誘導生長14天的實驗組和對照組細胞，制作爬片后進行免疫熒光檢測，結果顯示實驗組表達血管平滑肌細胞特有的表面抗原標記物α-SMA、Calponin、SM22α和SM-MHC，對照組無陽性表達，IgG為不加一抗，只加FITC二抗的自發光圖片。綠色為陽性表達，紅色為襯染的細胞核。

3討論

組織工程是目前對組織缺損修復的研究熱點，但其種子細胞的來源一直是所要解決的關鍵技術問題。脂肪干細胞來源廣泛、取材培養簡單方便，并具有多向分化潛能，是組織工程目前研究的熱點之一。原代及傳代后的ADSCs均有較高的干細胞相關抗原表達，經過傳代后，造血系和內皮系細胞的污染迅速降低，細胞成分得以相對純化，此實驗我們又通過MACS分選的方法分離出CD34+的細胞，使獲得的ADSCs得到進一步的純化。

在胚胎血管發生過程中，首先通過血管發生或血管生成的方式，內皮細胞延伸形成內皮細胞索，繼而形成血管內皮細胞管，構成脈管系統的基本框架。隨后，內皮細胞釋放募集因子，募集周圍間充質細胞向內皮細胞靠攏、貼附，包繞在管腔表面，形成最初的周細胞，然后在其它生長因子以及細胞間接觸作用下，周細胞分化形成血管平滑肌細胞并增殖為多層細胞，管壁不斷增厚，管腔逐漸延伸。在其過程中內皮細胞通過分泌PDGF-BB招募壁細胞前體細胞，PDGF-BB是間充質細胞強烈的有絲分裂原，促進其增殖[5-7];而TGF-β1是影響VSMCs 分化的最重要因子，此過程中分泌的TGF-β1加速了未分化的間充質細胞的增殖并向VSMCs的轉化，具有抑制細胞增殖作用，并促進周細胞向VSMCs 分化的作用[7]，因此我們選擇了在誘導液中加入這兩種生長因子。

血管平滑肌特異的細胞內標記物為α-SMA、Calponin、SM-MHC 和SM-22α[9]。Hirschi [10]認為，任何細胞的標記物都不是單一的存在于某種細胞，在其它種類細胞中都可能存在，某個單一的標記物表達不足以證實細胞向平滑肌細胞分化，如果同時檢測多種標記物的表達，該細胞可基本認定為平滑肌細胞。

我們對實驗組細胞進行了細胞形態、免疫熒光的檢測，誘導后的脂肪干細胞表現出平滑肌細胞所特有的峰谷生長模式;表達平滑肌細胞的標記物α-SMA、Calponin、SM22α和SM-MHC，可以初步認定脂肪干細胞在模擬體內血管平滑肌細胞生長的環境下，向血管平滑肌細胞表型轉化，為尋找新的組織工程種子細胞提供了新的思路。當然我們還需繼續檢測ADSCs分化的得到細胞是否具有血管平滑肌細胞的功能，為構建組織工程化血管提供新方法。

[參考文獻]

[1]Zuk PA， Zhu M， Ashjian P， et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell，2002，13: 4279-4295.

[2]Daniele Peroni，Ilaria Scambi，Annalisa，et al. Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells[J]. Experimental cell research，2008，314:603-615.

[3]Mizuno H，Zuk PA，Zhu M，et al .Myogentic differentiation by human processed lipoaspirate cells[J]. Plast Reconstr Surg，2002，109(1):199 -209. [4]Jack GS， Almeida FG， Zhang R， et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction[J]. Urol， 2005， 174 (5): 2041- 2045.

[5]Hirschi KK，Rohovsky SA，D'Amore PA. PDGF，TGF-β，and heterotypic cell-cell interactions mediate endothelial cell-induced recruitment of 10T1/2 cells， and their differentiation to a smooth muscle fate[J]. Cell Biol，1998，141: 805-814.

[6]Lindahl P，Johansson BR，Leveen P，et al. Pericyte Loss and Microaneurysm Formation in PDGF-B_Deficient Mice[J]. Science，1997，277: 242-245.

[7]Hirschi KK，Rohovsky SA，Beck LH，et al. Endothelial Cells Modulate the Proliferation of Mural Cell Precursors via Platelet-Derived Growth Factor-BB and Heterotypic Cell Contact[J]. Circ Res，1999，84: 298-305.

[8]Grainger DJ，Metcalfe JC，Grace AA，et al. Transforming growth factorbeta dynamically regulates vascular smooth muscle diff erentiation in vivo[J]. Cell Sci，1998，111(Pt 19): 2977-2988.

[9]Kashiwakura Y，Katoh Y，Tamayose K，et al. Isolation of bone marrow stromal cell-derived smooth muscle cells by a human SM22 alpha promoter: in vitro diff erentiation of putative smooth muscle progenitor cells of bone marrow[J]. Circulation，2003，107(16): 2078 -2081.

[10]Hirschi KK， Rohovsky SA， D'Amore PA. PDGF，TGF-beta， and heterotypic cell-cell interactions mediate endothelial cell-induced recruitment of 10T1/2 cells and their differentiation to a smooth muscle fate[J]. Cell Biol，1998，141(3):805-814.

[收稿日期]2009-10-23 [修回日期]2010-01-12

編輯/張惠娟