熱休克蛋白90促進糖尿病創面愈合的作用研究

[摘要]目的:研究HSP90在糖尿病性難愈創面中的作用。方法:在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠背部做d=2cm的全層皮膚缺損模型，并隨機分為四組:空白組(B組)、HSP90組(C組)、胰島素組(D組)及HSP90與胰島素聯合用藥組(E組)。另設一組正常大鼠同樣在背部做d=2cm全層皮膚缺損模型作為對照組(A組)，每組n=(5n1+n2)=20只，共100只大鼠，在創面形成后即時給予難愈創面藥物治療持續2天，A組則不治療。于創面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進行大體觀察及活體取材做常規病理學觀察，各時間點標本采用免疫組化ABC法觀察HSP90，并計算其平均密度值及積分光密度值，觀察其表達規律。結果:大體觀察下，在計算第21天的創面愈合率后我們發現， C組(85.9%)、D組(86.8%)及E組(96.8%)相較于B組(79.7%)創面愈合率均有顯著提高(P<0.05)，其中E組療效更加突出;而在鏡下觀察中，我們發現E組創面表皮增厚，上皮化活躍，表皮細胞排列規則，且HSP90在各時期的表達水平顯著增高(P<0.05)，C組與D組雖也有類似改變但不如E組顯著。結論:HSP90能夠提高糖尿病難愈性創面21天的愈合率，同時我們發現將HSP90與胰島素聯合應用后會取得更好效果，進一步提高創面21天時的愈合率。

[關鍵詞]熱休克蛋白90(HSP90);糖尿病;難愈創面;創面愈合

[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)05-0691-04

Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats

REN Jing，ZENG Hai-feng，XIA Wei，LIU Bei，LI Yong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds， causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline， the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline， the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline， the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed， and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test， using SPSS 14.0 software. On the 3th， 5th，7th， 10th， 14th and 21th， we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day， the wound closure rates of the group C(85.9%)，D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P<0.01)， The IOD and DM of HSP90 positive rate of group B was lower than in the groupC，D and E (P<0.05).ConclusionThe HSP90 combined insulin could have more effects for chronic wound healing in the diabetic rats. The results is suggested that HSP90 could promote chronic diabetic wound healing.

Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes

糖尿病造成的難愈創面已成為目前臨床治療的一大難題，研究表明，高糖會抑制人表皮細胞的遷移，從而導致創面上皮化延遲[1-2]。近來，Li.W的研究發現熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)能夠有效促進人表皮細胞的遷移[3]，而關于其是否能夠有效促進糖尿病性難愈創面的研究并未見報道。本實驗旨在將HSP90應用于糖尿病性難愈創面，并輔以胰島素作為參照，以觀察不同時期各組創面的愈合程度及創面中HSP90的表達含量。

1材料和方法

1.1動物及分組:選用健康清潔級雄性SD大鼠100只，由第四軍醫大學動物試驗中心提供，體重(200±3)g，分為A、B、C、D、E五組，每組20只。A組為正常創面但不予以任何治療，即對照組;B組為糖尿病大鼠難愈創面給予空白凡士林藥膏治療組，即空白組;C組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有HSP90的凡士林藥膏治療組，即HSP90組(HSP90濃度:1μg/ml);D組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有胰島素的凡士林藥膏治療組(胰島素濃度:30μg/ml)E組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有HSP90及胰島素的凡士林藥膏治療組，即聯合用藥組(E組，HSP90濃度:1μg/ml，胰島素濃度:30μg/ml)。每組n=(5n1+n2)=20只，共100只大鼠，

1.1.1 構建2型糖尿病難愈創面模型:采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)法誘導2型糖尿病造模。各組提前4周高脂高糖飲食，饑餓12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并維持高脂高糖飲食，并于注射后48h用強生穩步血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，FBG值>16.7mmol/L，體重明顯下降(>50g)為造模成功[4]。三天后補注STZ(以10～20mg/kg體重劑量腹腔注射)，并測量FBG值。切取全層皮膚暴露肉膜為準后以d=2cm的金屬環間斷縫合固定于創緣，防止創面攣縮。

1.1.2 給藥及分組:A組不涂抹任何藥物;B組為空白藥膏;C組為含有濃度1μg/ml HSP90的藥膏;D組為含有濃度30μg/ml胰島素的藥膏;E組為含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰島素的藥膏。各給藥組均以外用涂抹局部給藥，藥膏均勻覆蓋整個創面(約1g/次)為準(含有藥物的藥膏均委托金花生物制藥集團有限公司完成)。HSP90的濃度為我們參考了Li.W試驗中用于正常創面的治療濃度后[3]，并以15只糖尿病大鼠給予1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml進行了簡單的預實驗，發現三種濃度的效果并無顯著差異，所以取最小濃度。

6941，

2實驗過程及觀察設計

在創面形成后即時給予難愈創面藥物治療持續2天，A組則不治療，動物創面予以暴露。創面的固定環會于創面形成后的第10天予以摘除，因為此時皮膚攣縮力量較大，會導致縫合線斷裂，為統一標準予以摘除。并創面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進行大體觀察及活體取材做常規病理學觀察，在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5個時間點各取n1=3個標本，而在第21天取n2=5個標本，各標本取材時取全層厚皮膚，保留創緣約1～2mm的正常皮膚。

2.1 大體觀察指標:分別于用藥后第3、5、7、10、14、21 進行大體拍照觀察并采用ADOBE photoshop cs4 計算各時期的創面愈合率;

2.2 鏡下觀察指標:并于3、5、7、10、14、21天取創面標本，3、5、7、10、14天每組各時間點3只，21天時每組5只。皮膚標本剪成橫斷面，標本均用1%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，分別進行HE染色、并使用ABC法進行HSP90的免疫組化染色。并采用image pro plus 6.0彩色圖像分析系統， 每張切片選取5個有代表性的200倍視野，測量每個標本HSP90陽性表達密度及積分光密度IOD值的均值并記錄。

2.3 數據統計:所得試驗數據均采用SPSS11。文中數據以均數和標準差(x±s) 表示，并且對創面愈合率采用兩個獨立樣本t檢驗進行比較。

3實驗結果

3.1 大鼠創面愈合率差異比較:各組大鼠在各時間點創面愈合率比較見表1。由表可見，單獨使用HSP90(C組)及單獨使用胰島素(D組)均能夠提高創面的愈合率(與同期B組相比，P<0.05); HSP90及胰島素聯合應用(E組)后創面愈合率的提高更為顯著(與同期B組相比，P<0.01)并達到正常大鼠的創面愈合率(與同期A組相比，P>0.05)。但均能夠優于空白藥物組(P<0.01)。

3.2 各組創面第10天時HSP90的免疫組化對比:見圖1～5。由圖可見，聯合用藥組及正常創面對照組創面中，HSP90的陽性表達較為強烈。

3.3 HSP90陽性表達的比較:為更加客觀的反應HSP90在創面中的陽性表達狀況我們選取平均陽性率及積分光密度作為指標[5-6]。各組大鼠各時間點HSP90平均陽性率(Density Mean，DM)值的比較見圖6。各組大鼠各時間點創面中HSP90的平均積分光密度(Identical Optical density，IOD)的比較見圖7。

由圖6、圖7我們發現:①在糖尿病大鼠創面中，HSP90的表達明顯下調(同期對照組相比，P<0.01)，而使用胰島素改善創面的局部高糖微環境后，HSP90的陽性表達有所上調(同期對照組相比，P<0.05);②提高創面中HSP90的表達后，同期創面的愈合率也能夠得到明顯改善(同期對照組相比，P<0.05);③聯合應用HSP90及胰島素后，創面中HSP90持續過表達，且創面愈合率也是各難愈創面組中最高的，接近正常創面的愈合率(同期對照組相比，P>0.05);④HSP90在正常創面中，其表達在傷后第3天就為一個高峰，之后呈現緩慢下降趨勢;而在難愈創面中，其表達規律呈拋物線規律。空白組在整個創面愈合時期，HSP90陽性表達率都明顯下調(P<0.01)，而在單獨使用HSP90或胰島素時，HSP90的表達有所上升，高峰出現時間約為創傷第14天左右;而聯合應用這兩種藥物后，不僅HSP90的表達大大提升，并且HSP90的表達峰值也有所提前，至第10天左右。

4討論

美國創面愈合協會的資料顯示大約有66%的難愈性創面即使經過6個月的治療護理仍無法治愈[7]，僅處理創面的材料每年就花費90億美元[8]。糖尿病創面的治療一直是難題，表皮細胞遷移遲緩也是其發生機制的一個重要特點。 在糖尿病創面的臨床治療中，胰島素的局部應用的療效及作用機制均得到了驗證，這一方法也成為了臨床治療糖尿病創面的經典方法。而其作用機制主要在于降低創面組織血糖濃度，加快糖尿病創面的新生毛細血管形成，促進上皮細胞的增殖與遷移[9-10]。

2007年DR. Woodley等發現人表皮細胞受到缺氧刺激后，會大量分泌HSP90α，在胞外的HSP90α能夠有效促進人表皮細胞的遷移，并將其應用于正常創面，發現HSP90α能夠加速創面的再上皮化過程[3，11]。在此之前，人們對于HSP90的關注了解更多的集中在癌癥領域，作為重要的分子伴侶，它介導了多條調控細胞增殖、凋亡、遷移的信號通路[12]，并保護細胞產生應激反應，抵抗各類損傷帶給機體的不可逆性傷害[13]

在本實驗中我們主要為了研究HSP90是否能夠促進糖尿病性難愈創面的愈合，并觀察HSP90在糖尿病性難愈創面中的表達，探索HSP90在創面中的表達是否與創面的愈合速率有關聯。我們的研究發現:在大體觀察下，①外源性給予糖尿病性難愈創面HSP90，同期的創面愈合率有所提高(與同期空白組相比，P<0.05);②聯合應用胰島素及HSP90后，糖尿病性難愈創面的同期愈合率最高(與同期對照組相比，P>0.05)。僅從大體實驗的觀察結果我們認為，創面中HSP90的表達與糖尿病難愈創面的愈合是存在相關性的。在鏡下觀察，我們發現:①糖尿病性難愈創面的高糖微環境明顯抑制了HSP90的表達(空白組與同期對照組相比，P<0.01)，局部使用胰島素改善創面高糖微環境或局部給予HSP90后，糖尿病性難愈創面中HSP90的表達有所提高(與同期空白組相比，P<0.05);②將HSP90與胰島素聯合應用后則發現糖尿病性難愈創面中HSP90持續性過表達(與同期對照組相比，P<0.01)，并且其表達高峰也有所提前。

分析結果我們認為，高糖環境會降低HSP90在創面中的表達，減弱HSP90對細胞的保護作用。并且創面中HSP90的表達高低與創面的愈合速率具有相關性。雖然無論是局部給予胰島素改善高糖微環境，還是局部應用HSP90提高創面中HSP90的表達，均能夠提高糖尿病性難愈創面的愈合率，但是我們發現聯合應用后糖尿病性難愈創面的愈合效果最好。據此我們認為，胰島素改善了糖尿病性難愈創面的局部微環境，有利于創面中HSP90的表達提高，進一步局部給予HSP90，提高創面中HSP90的含量，從而激活部分HSP90參與調控的信號通路，提高創面中各類生長因子的表達，促進了糖尿病性難愈創面的愈合。

然而，我們的研究尚屬淺顯，對于HSP90在糖尿病創面愈合過程中的作用機制也未進行研究。但是，依然為我們尋找糖尿病創面的治療方向提供了一個具有臨床應用意義的思路。下一步，我們會對HSP90在糖尿病性難愈創面的作用機制進行進一步的研究，探索HSP90在糖尿病性難愈創面中所調控的與創面愈合密切相關的生長因子與細胞外基質的變化。并且HSP90的提取目前還很昂貴，所以進一步尋找到其穩定的上游信號分子或尋找一種能夠有效且廉價的提取HSP90的方法會成為我們今后的研究方向。

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[收稿日期]2010-02-26 [修回日期]2010-04-20

編輯/張惠娟

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