p38MAPK及其信號通路在鼻息肉中的作用

【摘要】:目的:研究p38MAPK及其信號通路在鼻息肉發(fā)病中的作用機(jī)制，以便更加深入的闡明鼻息肉的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療鼻息肉及尋找特異性治療藥物提供理論依據(jù)。方法:選取20例未采用糖皮質(zhì)激素治療的復(fù)發(fā)性鼻息肉組織標(biāo)本、20例初發(fā)鼻息肉組織標(biāo)本、20例正常鼻黏膜組織。實(shí)驗分為三組:A組:復(fù)發(fā)性鼻息肉組;B組:初發(fā)性鼻息肉組;C組:正常下鼻甲黏膜組，每組各20例。處理因素:體內(nèi)為布地奈德;體外為布地奈德、克拉霉素和p38MAPK特異性抑制劑SB203580。按1997海口標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期分型。上述標(biāo)本部分于-70℃凍存?zhèn)溆茫?1)采用HE染色和免疫組化染色對鼻息肉和正常鼻黏膜組織中的p38MAPK蛋白進(jìn)行觀測并拍照，并用JD109或JD801圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測定陽性細(xì)胞數(shù)密度和灰度值。(2)按常規(guī)Western-blot實(shí)驗操作步驟。結(jié)果判定:凝膠圖像分析系統(tǒng)對比p38MAPK與GAPDH灰度比值。實(shí)驗分體內(nèi)和體外兩個階段。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:p38MAPK在正常下鼻甲黏膜組織中無或極少量表達(dá)，在鼻息肉組織中均顯示高表達(dá)(P<0.01);復(fù)發(fā)型鼻息肉組織p38MAPK的陽性表達(dá)面積和密度均高于II型鼻息肉組(P<0.05)。結(jié)論:(1)p38MAPK在鼻息肉組織中高表達(dá)，而且在復(fù)發(fā)性鼻息肉組織中表達(dá)更顯著。(2)結(jié)果表明p38MAPK信號通路參與鼻息肉的發(fā)生發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】:鼻息肉;p38MAPK;免疫組織化學(xué)

【中圖分類號】R765.9【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)06-052-2

鼻息肉是一種常見病，發(fā)病率及復(fù)發(fā)率均較高，目前治療最有效的方法為鼻內(nèi)鏡手術(shù)加糖皮質(zhì)激素治療，但是治療后仍有20%左右復(fù)發(fā)，是鼻科目前治療的難點(diǎn)。多種炎癥因子的表達(dá)和EOS的作用是鼻息肉發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[1]。

隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，研究證明參與鼻息肉病理過程的化學(xué)介質(zhì)多達(dá)數(shù)十種甚至上百種。其中細(xì)胞因子(cytokines)的作用倍受重視。細(xì)胞因子是由機(jī)體的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成和分泌，具有較強(qiáng)的生物活性，廣泛存在于鼻息肉的微環(huán)境中。目前認(rèn)為鼻息肉主要是由多種細(xì)胞因子參與的一種持續(xù)性炎癥反應(yīng)。p38MAPK信號通路是新近闡明的參與炎癥機(jī)制的信號通路之一，可能在鼻息肉中起至關(guān)重要的介導(dǎo)TNF-α與COX-2的信號傳導(dǎo)作用。

鼻息肉的發(fā)病機(jī)制中可能也存在經(jīng)p38MAPK信號傳導(dǎo)通路信號的干預(yù)和調(diào)控。目前相關(guān)文獻(xiàn)中對p38MAPK信號傳導(dǎo)通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK在鼻息肉組織中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周圍出現(xiàn)異常表達(dá)，且核內(nèi)有磷酸化p38MAPK的表達(dá)[2，3]。

1材料和方法

1.1標(biāo)本的選取標(biāo)本選取近1年我院耳鼻喉科住院和門診行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的復(fù)發(fā)性鼻息肉患者20例，所有患者均有兩次以上鼻息肉手術(shù)史，術(shù)前均未接受過糖皮質(zhì)激素治療;初次鼻息肉患者20例，未進(jìn)行過鼻腔鼻竇手術(shù)，亦未接受過糖皮質(zhì)激素治療;行鼻腔淚囊吻合術(shù)或鼻中隔矯正術(shù)，取正常鼻黏膜組織20例。要求所有患者經(jīng)檢查無變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘、慢性支氣管炎、阿司匹林耐受不良和其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾患。并按1997?？跇?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期分型。研究前1個月內(nèi)未進(jìn)行激素和抗組胺藥物治療。經(jīng)手術(shù)取出組織，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2主要試劑(1)p38MAPK兔抗人多克隆抗體:購自美國Cayman公司，工作濃度1:250。(2)免疫組化二抗試劑盒SP-9001(生物素標(biāo)記羊抗兔IgG):購自北京中杉金橋生物試劑公司。(3)DAB染色試劑盒:購自北京中杉金橋生物試劑公司。(4)多聚賴氨酸:購自武漢博士德公司。(5)牛血清白蛋白(BSA):SIGMA公司產(chǎn)品。

1.3方法(1)石蠟組織塊制作:手術(shù)切除的鼻息肉和下鼻甲粘膜組織立即切成1.5×1.5×1.5mm3的組織塊，并快速投入10%甲醛溶液固定液中，固定12小時。酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟，包埋，待石蠟全部凝固后，推出蠟塊。(2)石蠟切片:修整蠟塊，調(diào)整控制切片厚度約5micro;m，切成薄片后，須粘在玻璃片上，以記號筆在玻片上編號，放入溫箱中烘干。(3)免疫組織化學(xué)檢測p38MAPK在鼻組織中的表達(dá):將切片脫蠟入水。(4)抗原微波修復(fù)。(5)血清封閉抗原Fc段受體:取出玻片勿洗，直接加非免疫血清(二抗同族)，置于濕盒中，4℃，過夜。滴加一抗:傾去血清，勿洗，滴加一抗p38MAPK(1:250)50μl。陽性對照采用一肝癌組織標(biāo)本同樣滴加一抗。陰性對照采用一鼻息肉石蠟切片，一抗用PBS替代。標(biāo)本置于濕盒中，4℃，過夜。次日，用PBS洗3min，重復(fù)3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗IgG，37℃，10～15min。用PBS洗3min，重復(fù)3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑，37℃，10～15min，再用PBS洗3min，重復(fù)3次。加入DAB顯色液，室溫顯色5～10min，鏡下控制反應(yīng)時間，適時終止顯色反應(yīng)。單蒸水沖洗，蘇木素復(fù)染幾秒鐘(稀釋1:5，過濾)，沖洗，切片脫水，透明，中性樹膠封片。

光學(xué)顯微鏡下觀察鼻組織中p38MAPK陽性表達(dá)情況。6個高倍視野光鏡下觀察照像，然后用JD109圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測定陽性細(xì)胞數(shù)密度和灰度值。

Western blot方法檢測磷酸化p38(p-p38)含量，各組分別切取50～100mg黏膜組織，盡量剪碎，按照北京普利萊公司胞漿胞核蛋白提取試劑盒的說明提取核蛋白。經(jīng)蛋白定量，每條泳道加樣15μL行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS 2PAGE)分離蛋白質(zhì)，經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。牛血清蛋白室溫封閉1h。加入稀釋度為1:200的兔抗p-p38多克隆抗體，4℃孵育20h。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋度為1:2000，室溫下孵育2h，經(jīng)TBS洗滌，DAB顯色，分析各條帶磷酸p38(p-p38MAPK)和β-actin的灰度值，并相除來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，作為p38的相對活化水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS12.0軟件分析系統(tǒng)，采用T檢驗分析組間顯著性差異，以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1p38MAPK免疫組化染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常鼻黏膜組織中無或少量弱陽性染色;在鼻息肉組中可見大量p38MAPK的陽性染色，陽性染色呈棕黃色顆粒，主要集中在胞漿;在體外實(shí)驗經(jīng)布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特異性抑制劑SB203580處理后，鼻息肉組中僅可見p38MAPK呈弱陽性染色。

2.2p-p38及β-actin凝膠電泳結(jié)果(見圖1)

為研究p38鼻息肉生成中的作用及機(jī)制，我們運(yùn)用westernblot白印跡法定量技術(shù)比較了核p38蛋白(P-P38)在三種組織中的表達(dá)水平，結(jié)果示P-P38在鼻息肉組及對照組灰度的相對值分別為:0.767士0.77和0.355±0.087。二者相比有顯著性差異(P<0.05)(見表1);經(jīng)布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特異性抑制劑SB203580處理后，P-P38在鼻息肉組灰度的相對值分別為:0.582士0.69。(見圖1)

表1 P-P38在鼻息肉和正常組織的表達(dá)(P-P38/β-action比值，x±s)

組別例數(shù)x±s

鼻息肉組 200.767±0.077

正常組150.355±0.087

圖1 P-P38及β-actin凝膠電泳圖

(A:為藥物干預(yù)前，P-P38表達(dá)為陽性;B:為藥物治療后，P-P38表達(dá)呈弱陽性。)

3討論

鼻息肉是一種常見病，發(fā)病率及復(fù)發(fā)率均較高，目前治療最有效的方法為鼻內(nèi)鏡手術(shù)加糖皮質(zhì)激素治療，但是治療后仍有20%左右復(fù)發(fā)，是鼻科目前治療的難點(diǎn)。鼻息肉的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前認(rèn)為鼻息肉主要是由多種細(xì)胞因子參與的一種持續(xù)性炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子是由機(jī)體的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞所合成和分泌，具有較強(qiáng)的生物活性，廣泛存在于鼻息肉的微環(huán)境中。p38MAPK信號通路是新近闡明的參與炎癥機(jī)制的信號通路之一，可能在鼻息肉中起至關(guān)重要的介導(dǎo)TNF-α與COX-2的信號傳導(dǎo)作用。

p38蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的蛋白激酶，激活后的p38即由胞漿進(jìn)入到細(xì)胞核，表現(xiàn)為其活性形式磷酸化p38(p-p38)，它是細(xì)胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[2]。p38MAPK(Mitogen-activated proteinkinase，MAPK)信號傳導(dǎo)通路是新近闡明的一條MAPK通路，p38MAPK被激活后，引起下游相應(yīng)的信號啟動并產(chǎn)生廣泛的病理生理效應(yīng)，通過“級聯(lián)”程序調(diào)控細(xì)胞因子和應(yīng)激引起的細(xì)胞反應(yīng)來快速實(shí)現(xiàn)信號傳遞，造成炎癥反應(yīng)“級聯(lián)放大”[3]。許多研究表明，p38信號傳導(dǎo)通路在炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘、慢性阻塞性肺病、變應(yīng)性鼻炎及慢性鼻-鼻竇炎中，p38MAPK的活化與各種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的釋放有關(guān)[4]。Boehme等研究證實(shí)，p38MAPK通路能夠被促炎因子TNF-ɑ所激活，TNF-α可快速誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞中的p38MAPK的磷酸化，并呈時間、劑量依賴關(guān)系。鼻息肉的黏膜病理生理學(xué)改變與哮喘、變應(yīng)性鼻炎及慢性鼻-鼻竇炎同屬于呼吸道黏膜炎癥反應(yīng)，且密切相關(guān)。據(jù)此推測，鼻息肉的發(fā)病機(jī)制中可能也存在經(jīng)p38M

APK信號傳導(dǎo)通路信號的干預(yù)和調(diào)控。目前相關(guān)文獻(xiàn)中對p38MAPK信號傳導(dǎo)通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK在鼻息肉組織中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周圍出現(xiàn)異常表達(dá)，且核內(nèi)有磷酸化p38MAPK的表達(dá)[2，3]。

本課題研究結(jié)果顯示，p38MAPK在鼻息肉組織中高表達(dá)，而且在復(fù)發(fā)性鼻息肉組織中表達(dá)更顯著。表明p38MAPK信號通路參與鼻息肉的發(fā)生發(fā)展

參考文獻(xiàn)

[1] 米淑娜，李志明.鼻息肉相關(guān)致病因素研究的新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(5):365-367.

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