產(chǎn)幾丁質(zhì)酶香蕉枯萎病拮抗菌的篩選\\鑒定及抑菌作用

摘要：為了篩選出對(duì)枯萎病菌有拮抗作用的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌。分別以香蕉枯萎病鐮刀菌細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)為唯一碳源進(jìn)行幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌初篩和復(fù)篩，然后通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，從幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌中篩選出一株香蕉枯萎病拮抗菌。通過(guò)形態(tài)特征和分子生物學(xué)分析，確定其為枯草芽孢桿菌并將其命名為XW-2。研究了不同溫度、pH值及碳源對(duì)XW-2菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果表明，發(fā)酵液在初始pH為7～8，溫度為31～34℃時(shí)活性最高，幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的發(fā)酵液活性高于病原菌細(xì)胞壁。發(fā)酵液能明顯抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)．拮抗試驗(yàn)可見(jiàn)病原菌菌絲縊縮、消解、頂端膨脹，菌絲體畸形、斷裂。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病；幾丁質(zhì)酶；枯草芽孢桿菌；篩選；拮抗機(jī)制

中圖分類號(hào)：S668.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2010)03-427-04

枯萎病是導(dǎo)致香蕉植株死亡的土傳毀滅性病害。引起香蕉枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種，該菌在土壤中營(yíng)兼性寄生，可在土壤或植株殘株中長(zhǎng)期存活。病菌通過(guò)植株根部傷口或從根毛頂端細(xì)胞間侵入植株體內(nèi)，最終進(jìn)人維管束。目前還沒(méi)有一種理想的化學(xué)防治藥劑。

一些幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌能抑制病原真菌生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)這些微生物所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能降解真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)，從而破壞真菌的細(xì)胞壁．使病原菌細(xì)胞生長(zhǎng)受阻。另外幾丁質(zhì)酶還可破壞病菌菌絲尖端新合成的幾丁質(zhì)，從而使菌絲停止生長(zhǎng)、縊縮畸形甚至解體消解。

研究于海南樂(lè)東地區(qū)枯萎病重發(fā)田中選取發(fā)病很輕植株，采集其根部土樣，分別利用病原菌細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)作為唯一碳源進(jìn)行雙重篩選。篩選出幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌．再利用拮抗試驗(yàn)從幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌中篩選出一株香蕉枯萎病拮抗菌株。進(jìn)一步研究表明該菌株對(duì)香蕉枯萎病鐮刀菌具有較好的抑菌效果．并對(duì)其抑菌作用進(jìn)行了研究，研究為該菌的應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試病原菌為分離自發(fā)病植株上的香蕉枯萎病鐮刀菌4號(hào)小種(Fusarium oxysporum f.sp.cubenserace 4)，經(jīng)回接確認(rèn)后保存。

鐮刀菌細(xì)胞壁固體培養(yǎng)基濕細(xì)胞壁100 g，瓊脂12g，加蒸餾水至1000mL，調(diào)pH值至7.2，高壓滅菌。菌的純化及保存采用NA培養(yǎng)基，病原真菌的培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn)[3]的方法并略有改動(dòng)。

1.2 方法

1.2.1 香蕉枯萎病鐮刀菌細(xì)胞壁的制備 在PDA液體培養(yǎng)基中接種病原菌，28℃振蕩培養(yǎng)3d，收集菌體并用液氮充分研磨破碎細(xì)胞，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)洗滌去除細(xì)胞內(nèi)容物后離心收集細(xì)胞壁，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生茵的雙重篩選 取10g土樣放入無(wú)菌水中充分振蕩后靜置15min，適當(dāng)稀釋后吸取上清液200μL涂布于鐮刀菌細(xì)胞壁固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，挑取形態(tài)特征各異的細(xì)菌菌落于NA固體培養(yǎng)基上反復(fù)純化后保存。

將所篩選出的細(xì)菌菌株接種于幾丁質(zhì)固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)并隨時(shí)觀察，挑取生長(zhǎng)良好、分解圈大且透明、邊緣清晰的菌落保存。

1.2.3 拮抗菌的篩選 在PDA平板培養(yǎng)基上接種病原菌，28℃培養(yǎng)2d后，在距平板中心2.5cm處接種篩選出的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌．每個(gè)培養(yǎng)皿中接種4個(gè)菌株。繼續(xù)于28℃培養(yǎng)并隨時(shí)觀察記錄抑菌情況．用對(duì)峙法初篩對(duì)香蕉枯萎病菌有拮抗作用的菌株。將拮抗效果較好的菌株連續(xù)進(jìn)行5代對(duì)峙培養(yǎng)觀察，優(yōu)選出抑菌效果穩(wěn)定的菌株于NA固體培養(yǎng)基上劃線保存。

1.2.4 菌株的鑒定 在NA培養(yǎng)基上劃線接種拮抗菌，30℃培養(yǎng)并連續(xù)觀察菌落形態(tài)。另用接種環(huán)取少量菌絲于載玻片上．用生理鹽水適當(dāng)稀釋后置光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)特征觀察。細(xì)菌形態(tài)特征的觀察參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

經(jīng)優(yōu)選的拮抗菌株于NA固體培養(yǎng)基上劃線出單菌落后送大連寶生物公司進(jìn)行16SrDNA序列測(cè)序。將所得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，選取其中親緣關(guān)系最近的10個(gè)菌株的16SrDNA序列，用ClustalX和MEGA3.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵液活性的影響 在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，將拮抗菌菌株分別接種于不同pH值和不同溫度的幾丁質(zhì)液體培養(yǎng)基中．200r·min^-1搖床培養(yǎng)4d，培養(yǎng)液于4℃，8000r·min^-1離心5min。上清液用0．22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ靡志Ψy(cè)定不同初始pH值和溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。pH值分別設(shè)定為4、5、6、7、8、9共6個(gè)梯度，溫度梯度設(shè)為25℃、28℃、31℃、34℃，37℃、40℃。每處理重復(fù)3次，取其平均值。

在確定了最佳pH和生長(zhǎng)溫度的情況下．分別以鐮刀菌細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)為唯一碳源制備液體培養(yǎng)基，在2種培養(yǎng)基中接種拮抗菌，200r·min^-1搖床培養(yǎng)4d后用抑菌圈法測(cè)定不同碳源對(duì)發(fā)酵液活性的影響。

在50℃左右100mL熔融態(tài)的PDA固體培養(yǎng)基中加入1mL病原菌孢子懸浮液，搖勻制成每皿約25mL培養(yǎng)基的平板，在平板中央放置一滅菌牛津杯，杯中加入200μL發(fā)酵液，28℃恒溫培養(yǎng)。通過(guò)測(cè)量抑菌圈的大小比較不同處理?xiàng)l件下發(fā)酵液的抑菌活性。病原菌孢子懸浮液制備參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.6 拮抗力發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

在以病原菌細(xì)胞壁為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中接種拮抗菌，并按1.2.5中所述抑菌圈法觀察發(fā)酵液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響，挑取抑菌圈邊緣的病菌菌絲，于光學(xué)顯微鏡下鏡檢菌絲形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

從鐮刀菌細(xì)胞壁固體培養(yǎng)基上分離得到形態(tài)各異的細(xì)菌菌株87株，經(jīng)純化后接種幾丁質(zhì)平板．再選出分解圈大而且透明，邊緣清晰，生長(zhǎng)良好的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌10株，然后通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)從這些幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌中篩選出對(duì)香蕉枯萎病菌有抑制作用且抑菌效果穩(wěn)定的XW-2菌株(圖1)。

2.2 X-W-2菌株的分類鑒定

XW-2菌株在NA培養(yǎng)基上菌落呈圓形。灰白色或淡黃色，表面粗糙有皺褶，邊緣不整齊，菌落較干燥，菌層較厚，邊緣有白色毛邊。光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞呈桿狀，大小為0.7μm～0.9μmx2.0μm～3.5μm，革蘭氏染色陽(yáng)性，芽孢卵圓型。XW-2菌株的16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株XW一2與Bacillussubtilis G8 (EF491625)， Bacillus subtilis

B3(EF492885)，Bacillus subtilis BIHB(FJ859701)聚于同一分支中，與以上3者相似性超過(guò)99％(圖2)。結(jié)合該菌株的形態(tài)特征和分子生物學(xué)分析鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Baeillus subtilis)。其16S rDNA序列已在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)(GenBank aeees-sion GQ305125)。

2.3 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵液活性的研究

用抑菌圈法測(cè)定了不同發(fā)酵條件下拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑菌活性。實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵液活性最高的pH為7～8。初始pH值小于4或大于9時(shí)發(fā)酵液活性很低。活性產(chǎn)生的最適溫度為31～34℃，溫度在40℃以上時(shí)，幾乎不能產(chǎn)生活性物質(zhì)(圖3)。

通過(guò)比較不同碳源的發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用表明．兩者都可抑制病原菌的生長(zhǎng)，說(shuō)明拮抗菌可有效利用細(xì)胞壁為唯一碳源，產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。但是以幾丁質(zhì)作為碳源的發(fā)酵液其抑菌活性較高。

2.4 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲的作用

挑取抑菌圈邊緣的菌絲在光學(xué)顯微鏡相下觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌菌絲生長(zhǎng)受到抑制，菌絲縊縮，破裂、消解、頂端膨大，菌絲體畸形、斷裂(圖4)，表明XW-2菌株發(fā)酵液能有效抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)。

3 討論

枯草芽孢桿菌在自然界廣泛存在．能產(chǎn)生具有較強(qiáng)抗逆能力的芽孢，可以耐受各種不良環(huán)境，因此是一種理想的生防微生物。關(guān)于枯草芽孢桿菌的生防機(jī)制，近些年國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為其作用方式多種多樣，包括營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗菌物質(zhì)、溶菌作用和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等幾個(gè)方面。枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，包括抗生素、細(xì)胞壁降解酶及抗菌蛋白等，這種活性物質(zhì)的多樣性可產(chǎn)生不同的防病機(jī)制，增強(qiáng)了病害的防治效果。

本實(shí)驗(yàn)前期研究中發(fā)現(xiàn)在枯萎病流行香蕉田中有數(shù)塊發(fā)病很輕田塊。造成這種現(xiàn)象的原因可能是植株根部土壤中存在抑制病原菌生長(zhǎng)的拮抗菌。因此．我們采集植株根部土樣進(jìn)行了篩選．而且從這種環(huán)境中篩選出來(lái)的拮抗菌接種植株后拮抗效果會(huì)更穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)采用鐮刀菌細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)分別作為唯一碳源進(jìn)行雙重篩選培養(yǎng)，提高了篩選的有效性和針對(duì)性，對(duì)峙實(shí)驗(yàn)表明所篩選出的拮抗菌對(duì)香蕉枯萎病有較強(qiáng)的抑菌作用，顯微觀察發(fā)現(xiàn)抑菌圈邊緣的菌絲頂端膨大、菌絲斷裂、消解等現(xiàn)象。推測(cè)可能是XW-2拮抗菌分泌的幾丁質(zhì)酶分解了菌絲和細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)。造成細(xì)胞壁破損，細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，生長(zhǎng)畸形等。幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶．大多數(shù)幾丁質(zhì)及幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物均能誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。而且由于底物不同，誘導(dǎo)產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶及作用機(jī)理也不同。下一步將對(duì)XW-2菌株分泌的活性物質(zhì)組分進(jìn)行鑒定并對(duì)作用機(jī)理做深入的研究。