菠蘿基因組SSR分子標記的開發

摘 要：實驗采用sAM法，以“臺農17號”菠蘿作為開發基因組SSR分子標記的植物材料，并對開發獲得的SSR標記在16個菠蘿品種中進行了驗證。利用兩對錨定引物和12對接頭引物篩選菠蘿基因組SAM文庫，從中開發得到86條含有SSR位點的序列，對這86條序列用MISA軟件搜索后得到94個SSR位點，其中單核苷酸重復3個，二核苷酸重復91個。二核苷酸重復僅有2種重復單元，一種是GA／CT，占二核苷酸重復總數的57.14％(52／91)，另一種是AC／GT，占二核苷酸重復總數的42.86％(39/91)。研究未發現三核苷酸及以上的重復單元。36對SSR引物對16個材料的擴增結果顯示，24對引物能夠擴增出清晰、重復性好且符合預期大小的條帶，其中13對引物具有多態性，可成為下一步構建菠蘿指紋圖譜、遺傳多樣性分析及基因定位等研究中有用的SSR標記。

關鍵詞：菠蘿；基因組SSR標記；開發；驗證

中圖分類號：S668.3 文獻標識碼：A 文章編號：1009—9980(2010)04—551—05

菠蘿[Ananas comosus(L)Merr.]為鳳梨科(Bromeli—aceae)鳳梨屬(Ananas)多年生常綠草本果樹，與香蕉、椰子、杧果并稱為4大熱帶名果，主要有3個品種群：皇后類、卡因類、西班牙類，在菠蘿的栽培及傳播過程中，由于傳播者及當地栽培者的習慣命名不同，各品種的別名特別多，出現了異名或多名的現象，造成了菠蘿品種名稱混亂的現象，而且各大類群品種的變異性大，這不但阻礙了菠蘿種質資源的合理利用，也影響了菠蘿的品種改良與育種。目前采用分子標記技術對菠蘿的研究，主要是RFLP和RAPD應用的相關報道。2001年，Duval等應用RFLP技術，分析了菠蘿種質的遺傳多樣性。通過對葉綠體DNA限制性位點變異研究揭示了Ananas和其近緣屬的關系，Fatima等應用RAPD標記對2個屬共18份菠蘿種質進行了評價。Sergio等運用RAPD對2種不同方法得到的菠蘿微繁體忠實性進行了評價。而菠蘿SSR標記方面相關的開發及應用尚無相關報道。

從基因組開發SSR引物的方法主要有：經典的篩選基因組文庫的方法、微衛星富集法錨定PCR技術、STMP(sequence tagged microsatellite Pro—filing)法和選擇性擴增微衛星法(Selectively Ampli—fled Microsatellite，SAM)。其中，SAM法開發的SSR標記，具有能產生多基因座SSR指紋，有用SSR片段的回收率高，只須合成一個特異引物，即可檢測到相應的多態性SSR位點，而且具有比與傳統方法相比成本大大降低等優點。我們采用SAM法開發菠蘿的SSR標記，并對開發的SSR標記進行驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

以臺農17號(A.comosus cv.Tainong-17)作為開發SSR分子標記的植物材料，以16個菠蘿材料對開發的基因SSR標記進行檢測(表1)。材料來源于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所和中國熱帶農業科學院南亞研究所。大腸桿菌E coli(Escherichia coli)DH5a由本實驗室保存。

1.2 基因組DNA提取及SAM反應體系的建立

DNA提取采用改良的CTAB法㈣，建立基因組文庫參考SAM法。在1μg基因組DNA工作液中加入15U·μL^-1Pst l 0.3μL，10U·μL^-1Mse l 0.5μL，10xNEB bufferⅡ5.0μL，10mg·L^{-1BSA 0.5μL，37℃反應1h，65℃10min終止反應。加入5pmolPst I接頭和50pmol Mse I接頭，45℃5min。加入0.5U T4連接酶，1.8μL 100mmol·L-1 dATP和足夠的T4緩沖液使總體積達到30μL，16℃反應12h。SAM—PCR的產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。用于建立基因組文庫所用的接頭和引物序列見表2。}

1.3 目的條帶的測序及序列分析

對分離得到的目的條帶回收、克隆并測序，用MISA軟件(MIcroSAtellite)(http：//www.pgre.ipk-gatersleben.de/tulsa)對測得的序列進行SSR搜索，搜索標準為：單核苷酸重復的次數在10次或10次以上，二或三核苷酸重復的次數在6次或6次以上，四、五、六核苷酸重復的次數在5次或5次以上，同時，也篩選中間被堿基(間隔小于100或等于100)打斷的(interrupted)復合型SSR。二核苷酸重復如AT/TA，CT/GA看作是一種類型的重復基元。

1.4 特異性引物的合成

用stackPACK v 2.2 program進行聚類分析。用PRIMER5.0設計引物，主要參數為：GC含量為40％～60％，退火溫度(Tm)為49～57℃，預期擴增產物長度在100～300bp，設計的引物由Introvigen公司合成。

1.5 PCR擴增和電泳檢測 20μL PCR反應體系包括：10xPCR buffer，1.5mmo]·L^-1MgCl₂，0.25mmol·L^-1dNTPs，5pmol正、反向引物，20ng模板DNA，0.15UT_Taq聚合酶；反應程序為：94℃預變性3min，30個循環(94℃變性30s55℃退火45s，72℃延伸1min)，72℃延伸7min。PCR產物的分離用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測。

按照相同遷移位上有多態性擴增的條帶記為“1”，無帶為“0”，缺失為“9”，用UPGMA(UnweightedPair Group Method with Arithmafic)法進行聚類分析，用NTSYSpc vet 2.1(http：//www.xetersoftware.com/)軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 基因組SSR的分布

SAM-PCR的產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染后選取約200～750bp的條帶進行回收。共挑選99個條帶進行克隆測序。測得的99條序列中，有86條序列包含有SSR位點。不同的錨定引物和接頭引物組合得到的序列條數如表3所示。86條序列聚類分析后，得到68條單個序列，8組重復序列，對這76條(組)序列用MISA檢索重復位點，發現單核苷酸重復3個，二核苷酸重復91個，其中，GA／CT重復位點有52個，依重復次數計數為：6次最多40個、7次有6個、8次和9次各2個、15和18次各1個；AC／GT重復位點有39個，依重復次數多少計數：6次重復最多有15個，7次次之11個，8次有10個，9次1個，10次2個，

Pstl SAM引物和5′錨定引物PCT／PGA的組合開發得到51條序列，和5′錨定引物PAC／PGT的組合開發得到35條序列(表3)。

2.2 基因組SSR標記的開發

以76條序列設計得到的36對特異SSR引物，對16份供試材料進行擴增，檢測到24對引物可產生清晰、穩定，符合期望大小的條帶，其中13對為多態性引物能夠擴增出36條帶，其中有27條(75％)為多態性條帶如圖2。對擴增結果進行讀帶和聚類分析，得到樹狀圖。

如圖1所示，在相似系數大約為0.60時，可將16個品種分成兩類。第1類群包括臺農17號、N67-10、Perolera、Queensland Cayenne、臺農19號、無刺卡因、印尼無刺、夏威夷；第Ⅱ類群包括巴厘、NatalQueen、Puket、紅西班牙、Common Rough、Riply Queen、臺農16號、臺農4號。

3 討論

3.1 SAM法分離SSR標記的效率

本研究得到13對有多態性的引物，約占13.1％，比鄭麗珊等用同樣的方法從云南野蕉基因組中開發得到44％的多態性SSR引物要低?？赡艿脑蛴袃煞矫妫阂皇潜狙芯坎捎昧藘蓪﹀^定引物和不同接頭引物的組合來開發SSR引物，不同錨定引物之間開發出的SSR位點數量是有差異的，這與不同重復位點在基因組分布的頻率有關；二是2種材料之間的差異。微衛星重復序列廣泛分布在基因組之間，但其含量、類型及重復的長度在不同的物種中存在差異，即使同一物種的不同群體中也會存在差異㈣。

相比之下，用SAM法開發SSR標記的效率要比用經典的構建和篩選插入小片段基因組文庫的方法或STMS高，Tokuko等用經典方法在6.000個克隆中得到3個含SSR序列的陽性克隆，開發效率為0.05％，而Rajora等用STMS法在4.028個克隆中得到71個陽性克隆，開發效率為1.8％，均比本研究中開發效率低；而磁珠富集法開發效率很高，操作相對復雜，較適合于進行大量SSR標記的開發。

3.2 SSR序列的分析

Pst I SAM引物和5′錨定引物PCT／PGA的組合開發得到55個序列，和5′錨定引物PAC／PGT的組合開發得到44個序列，可推測在菠蘿基因組中，CT／GA含量比AC／GT稍高，MISA軟件對位點檢測的結果也證明了這一點(CT／GA重復為55.3％，AC／GT重復為41.5％)。

本研究中，只得到了單核苷酸重復和二核苷酸重復2種重復類型，與Rivera等和Viruel等用此法得到的結果相比偏少，原因可能在于，第一，預擴增引物3’端選擇性堿基的存在降低了模板的復雜性，但同時也減少了SSR位點的獲得；第二，與搜索重復位點時設定的參數有關，如果把六核苷酸重復的搜索條件設定為4次時，發現有一個CAAACA／TGTTTG重復位點；第三，與實驗方法有關。

3.3 遺傳多樣性分析

SSR標記能在分子水平上揭示物種間的多態性，在種質資源分類及親緣關系分析方面己得到廣泛的應用。本研究利用開發得到的13對多態引物對16個菠蘿品種擴增結果顯示，在相似系數為0.60的水平上，可將16個品種分成2類：第1類全部是卡因類，第Ⅱ類除紅西班牙外都為皇后類。在卡因類和皇后類的雜交品種中、臺農4號、臺農16號與皇后類聚在一起，臺農17號和臺農19號則與卡因類聚在一起。紅西班牙被聚類在第Ⅱ類群中，表明它與皇后類的親緣關系較近。利用開發的SSR標記對16個材料的分析結果與形態特征的歸類和系譜關系都比較一致。表明這些開發的標記可以用于菠蘿種質資源、親緣關系分析及指紋圖譜的構建。

4 結論

用SAM方法克隆測序了99條序列，分析得到86條包含SSR重復位點的序列，設計的36對SSR引物中，篩選到13對有多態性的，對16個菠蘿品種的擴增結果，證明了SAM法開發SSR標記的有效性，這是國內第1次使用該技術從菠蘿基因組中開發SSR標記。開發的13對SSR標記適用于構建菠蘿指紋圖譜及進行下一步的研究。