紅肉蘋果(Malus pumila var.niedzwetzkyana)MpMYB30基因的克隆及表達載體的構建

摘 要：MYB轉錄因子是植物轉錄因子中最大的家族之一，在轉錄調節中起著多方面的重要作用。實驗利用RACE技術從野生紅肉蘋果(Malus pumila var.niedzwetzkyana Schneid.)中獲得了M9MYB30的全長序列，利用生物信息學的方法對其蛋白進行了分析和預測并將其連接到pCAMBIA—S1300+植物表達載體中。結果表明，該基因全長為1 661bp，推導的氨基酸序列經系統發育分析與葡萄MYB30及蓖麻MYB基因相似性最高，命名為MYB30，其N端含有2個約55個氨基酸組成的MYB特征結構域。該基因推導的YB30蛋白的分子式為C₁₇₉₀H_{2794N538O584S12，相對分子質量為41579.8ku，等電點為6.30，不存在信號肽和跨膜區域，蛋白質結構以d螺旋為主。利用Xbal I 和Sac I對重組質粒進行酶切，并將其連接到pCAMBIA-S1300+載體上，通過抗性篩選和PCR酶切檢測，證實了MpMYB30基因已經構建到植物表達載體pCAMBIA—S1300+上。}

關鍵詞：紅肉蘋果；MpMYB30；生物信息學；表達載體構建

中圖分類號:S661.1 文獻標識碼：A 文章編號： 1009-9980(2010)04-483-07

MYB轉錄因子最早從鳥類的白血病病毒AMV和E26中發現，是植物中最大的轉錄因子家族之一，其共同特征為含有MYB結構域。植物中的MYB類轉錄因子在二次代謝、細胞的形態建成、環境應答、細胞周期調控、脂肪酸生物合成以及激活過敏細胞程序性死亡應答中起到一定的調控作用。Daniel等從擬南芥中分離到一個參與抗病反應的AtMYB30基因，研究結果表明其在細菌引起的HR反應中激活調控細胞死亡的起始。2008年，Raffaele等，更進一步提出作為植物細胞死亡的信使，At-MYB30參與調節HR反應及其自身的脂肪酸長鏈和其延伸物。

紅肉蘋果，古書稱其奈。紅肉蘋果為落葉喬木，為我國蘋果樹中的稀有品種，具有抗逆性強、豐產等特點，是育種的珍貴材料。因此，以紅肉蘋果為試材，旨在尋找和分離更多MYB基因，為蘋果育種工作開創嶄新途徑。

我們利用RACE技術，克隆了野生紅肉蘋果MpMYB30基因，利用生物信息學的方法對其推導的氨基酸進行了分析和預測，并將其連接到植物表達載體中，從分子水平上揭示MYB蛋白的進化關系、理化性質、跨膜區域及其空間結構，從而為下一步研究該基因的功能及其作用機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 野生紅肉蘋果由遼寧省興城果樹研究所蘋果國家種質資源圃提供。

1.1.2菌株和栽體大腸桿菌DH5a菌株由本實驗室保存，pMDl8simple-T載體購自TaKaRa公司。

1.1.3 主要生化試劑 反轉錄酶購自ToYoBo公司，限制性內切酶、rTaq酶、Hs-Taq酶、RNase H酶、dNTP、DNA Marke購自TaKaRa公司，DNA膠回收試劑盒為愛思進公司生產。引物由上海英俊生物有限公司(invitrogen)合成，表達載體pCAMBIA-S1300+為本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1 RNA提取與合成 葉片總RNA的提取采用CTAB法㈣。按照ToYoBo公司反轉錄酶使用方法進行，20μL反應PCR體系含有：XμL(1μg)總RNA，4μL 5xRTbuffer，2μL dNTP混合物(10mmol·L^{-1)，1 μL RNase抑制劑(10U·μL-1)，1μLRll466(表1)和1μL酶，其余用RNase-Free ddH₂O補齊。PCR反應程序：37℃10min，42℃40min，99℃min，4℃10min。合成后的cDNA于-20℃保存備用。}

1.2.2 MpMYB30基因保守片段擴增 以cDNA為模板，用引物F1和R1(表1)進行PCR擴增，反應體系為25μL：cDNA 1μL，引物各1μL，rTaq酶0.125μL，dNTP 2μL，MgCl₂1μL，ddH₂O 16.875μL；反應參數為94℃預變性4min，94℃45s、56℃40s、72℃2min、40個循環，72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目標片段，進行克隆，測序由上海英俊生物有限公司(invitrogen)完成(下同)。以該序列為靶序列，在蘋果的EST數據庫中進行搜索，并利用DNAMAN5，22軟件對同源性大于70％的序列進行拼接，獲得了該轉錄因子cDNA的5’端和部分開放閱讀框(0RF)序列。

1.2.3 MpMYB30基因的3’RACE以cDNA為模板，用引物MYB30-3’和R16324(表1)進行PCR擴增，反應體系同1.2.2。

1.2.4 生物信息學分析將測序得到的核酸序列和推導的氨基酸序列分別在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上用BLASTn和BLASTp進行序列相似性分析。BLAST比對，用ORFFinder尋找開放閱讀框，并對MYB結構域進行分析。用DNAMAN對Genbank數據庫中登錄的各物種MYB基因完成多序列比對。分子系統進化樹的構建使用軟件Clustalx對序列進行多重比對后，使用MEGA4對系統樹進行構建，生成報告圖形，完成進化樹繪制。用Protparam分析MpMYB編碼蛋白的氨基酸序列組成、相對分子質量、等電點等理化性質(http：//au.ex—pasy.org/tools/protparam.html)；利用TMHMM Serverv.2.0程序進行蛋白質跨膜區段預測(http：//genome，ebs.dtu.dk/services/TMHMM/)；利用Signal P程序分析N-末端的信號肽序列(http：//genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；利用PSIPRED預測MpMYB30蛋白的二級結構(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk／psipred/psi—form.html)：利用SAM-T08程序預測MpMYB30蛋白的三級結構(http：//compbio.soe.ucsc.edu/SAM-T08/T08-query.html)。

1.2.5 MyMYB30基因表達載體的構建及鑒定 以cDNA為模板，利用引物30-1和30-2(表1)進行PCR擴增?；厥漳康钠尾⑵渑cPMDl8simple-T載體連接，測序正確后，經Sac I和XbalI雙酶切回收目的片段與pCAMBIA-S1300+酶切后回收的載體用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌。PCR鑒定，提取質粒進行酶切鑒定。

2 結果與分析

2.1 紅肉蘋果MpMYB30基因的克隆及序列分析

以紅肉蘋果eDNA為材料進行PCR擴增，獲得了350bp左右的目標基因片段，測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對，結果顯示該堿基序列與葡萄(Genbank登錄號：XM002265978㈣)的同源性為83.0％。以該序列為靶序列，在蘋果的EST數據庫中進行搜索，并利用DNAMAN5，22軟件對同源性大于70％的序列進行拼接，獲得了該轉錄因子cDNA的5’端和部分開放閱讀框(ORF)序列。在起始密碼子處設計基因特異引物，通過3’RACE技術擴增到大約1400bp的目的片段，生物信息學分析結果表明，該序列全長為1661bp，最大ORF為1125bp，編碼374個氨基酸(圖1)。

MYB蛋白中含有1～3個串聯的、不完全重復的MYB結構域(R1、R2和R3)，每個MYB區折疊成螺旋一轉角一螺旋的形式參與與不同DNA部位的結合，從而使MYB轉錄因子具備不同的功能㈣。已有研究表明，在擬南芥、玉米和金魚草等真核生物中數量龐大、功能多樣的還是含有2個MYB區(R2和R3)的MYB蛋白。該基因和蘋果及其他植物的MYB氨基酸序列比對表明，推導的氨基酸序列與蓖麻(Rici—nus communis)中MYB基因的同源性最高，為94％：與蘋果的MdMYBl8(Genbank登錄號：AAZ20434)和Md—MYB23(Genbank登錄號：AAZ20439)的同源性均為82％。保守區氨基酸序列同源性較高，有2個HTHDNA-binding結構域(第15位氨基酸和120位氨基酸之間，圖2黑色的上劃線表示處)，此結構域具有序列特異性，約由55個氨基酸構成，為R2R3MYB亞類的特征結構域(圖2)，但在非保守區氨基酸序列差異較大。

2.2 MpMYB30的分子進化樹

為了進一步分析MYB類轉錄因子的進化關系，我們選定GenBank中與紅肉蘋果MRMYB30同源性超過50％的氨基酸序列進行系統發育分析(圖3)。植物中的R2R3MYB家族分為22個亞類，將得到的對細胞的敏感反應(HR)過程中做出快速、瞬時、特定表達的特點氨基酸序列與已登錄的擬南芥(Ara-bidosis thaliana)、葡萄(Vitis viifera)、金魚草(An—tirrhinum majus)、柑橘(Citrus macrophylla)、大豆(Glycine max)和蓖麻(Ricinus communis)等的相關R2R3MYB亞類基因進行聚類分析，結果表明，這些基因分別屬于第一、二、九、十一亞類。紅肉蘋果MpMYB30屬于R2R3MYB，和擬南芥AtMYB31、At一MYB96的進化距離較近，在同一亞類，它們都屬于MYB家族中的第一亞類，MpMYB30與蓖麻、葡萄的MYB基因相似性最高，而與玉米、金魚草等植物中的MYB基因也在同一亞類，并具有非常相似的DNA-binding結構域和功能特點，相關研究表明，亞組1成員蛋白和長鏈脂肪酸的合成(VLCFAs)有關，并可能通過長鏈脂肪酸本身或者其衍生物為植物細胞死亡的信號來正調控敏感反應(HR)過程.因此我們初步推測MpMYB30在細胞的敏感反應(HR)過程中能夠做出快速、瞬時、特定表達。但是，MpMYB30與蘋果的MdMYBl8和MdMYB23的相似性較低，并不在同一分類中。

此外，R2R3MYB亞類之所以可以分為22個亞類，與DNA-binding結構域的可塑性密不可分，這種在識別、結合DNA能力上的可塑性的存在，就使得在結構上非常相似的MYB轉錄因子可能識別不同的DNA部位，從而具備不同的功能。

2.3 MpMYB30蛋白理化性質的預測

用Protparam預測紅肉蘋果MpMYB30蛋白的理化性質，推測該蛋白的分子式為C₁₇₉₀H₁₂₇₉₁，N₅₃₈O₅₈₄S₁₂，相對分子質量為41579.8，等電點為6.30；理論推導半衰期大約為30h，不穩定參數為42.23，為不穩定蛋白(標準40以下為穩定蛋白)。該蛋白中相對含量比較多的氨基酸是Asn(38個.10.2％)、Ser(36個.9.6％)、Leu(32個，8.6％)；該蛋白中含量比較少的氨基酸是Met(6個，1.6％)、Tyr(6個，1.6％)和Cys(6個，1.6％)?？偟膸ж撾姾傻臍埢?Asp+Glu)為42；總的帶正電荷的殘基(Arg+LYs)為36。親水性平均數-為0.841，并且其脂肪指數為66.58。預測該蛋白為親水性蛋白，可能與含有較多的Asn有關。

2.4 MpMYB30蛋白跨膜結構區分析

利用TMHMM Server v.2.0軟件對MpMYB30蛋白進行蛋自質跨膜區段預測，結果表明紅肉蘋果的MpMYB30蛋白整條肽鏈都位于細胞膜外，說明野生紅肉蘋果的MpMYB30蛋白不存在跨膜結構域。

2.5 MpMYB30疏水性/親水性分析

利用EXPASY程序對野生紅肉蘋果的ip—MYB30蛋白質疏水性和親水性分析結果表明，該mpMYB30第81位Gln(Q)疏水性最強，第260位Asn(N)親水性最強；而且大部分的氨基酸屬于親水性氨基酸，因此紅肉蘋果MpMYB30轉錄因子屬于親水性蛋白。但在MYB結合區域(第15位氨基酸和120位氨基酸之間)中，一般都含有3個保守的色氨酸殘基(其間隔18-19個氨基酸)，起著疏水核心的作用，研究表明這種結構對于維持MYB的特征結構域有著重要的意義。

2.6 脅MYB30信號肽分析

利用SignalP程序分析MpMYB30蛋白，發現預測蛋白質序列的信號肽位置：神經網絡(Neural networks，NN)和隱馬爾科夫模型(HiddenMarkovModel，HMM)預測到相同的結果，該蛋白不存在信號肽序列。

2.7 MpMYB30蛋白的二級及三級結構的預測

利用SAM-T08程序預測紅肉蘋果MpMYB30蛋白的三級結構和PSIPRED程序預測紅肉蘋果MpMYB30蛋白的二級結構相吻合，結果如圖4、5所示，mpMYB30蛋白以α螺旋為主，并通過長鏈轉角連接起來，符合MYB蛋白折疊成螺旋一螺旋一轉角一螺旋(helix-helix-turn-helix，HHTH)的特征結構(圖4，5)。

2.8 MpMYB30雙元表達載體的構建及鑒定

以MpMYB30的eDNA為模板，PCR擴增Mp—MYB30基因，同時引人Sac I和Xbal I酶切位點，回收PCR產物，將其與pCAMBIA-S1300+中間載體分別用Sac I和XbalI雙酶切，將回收后的兩片段用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌。提取質粒，酶切鑒定。菌液PCR鑒定陽性克隆。

3 討論

MYB類蛋白普遍存在所有真核細胞中，在高等植物中家族也格外龐大。目前國內外的研究主要集中在R2R3-MYB亞類轉錄因子的基因克隆、結構鑒定、表達及其相關功能分析。本文利用RACE技術，從紅肉蘋果中克隆到了MpMYB30的全長序列，利用生物信息學的方法對其表達的蛋白進行了分析和預測并將其連接到pCAMBIA-S1300+植物表達載體中。結果表明MpMYB30屬于R2R3-MYB家族第1亞組，該亞組成員MYB30蛋白最早發現在擬南芥中，MYB30蛋白和長鏈脂肪酸的合成(VLCFAs)有關，并可能通過長鏈脂肪酸本身或者其衍生物為植物細胞死亡的信號來正調控敏感反應過程(HR)。此外，該基因N端保守的DNA-binding結構域是該類轉錄因子最關鍵的結構域，決定轉錄因子與不同作用元件的結合，MpMYB30蛋白的二級結構和三級結構均顯示此蛋白含有大量的α螺旋結構，符合R2R3-MYB蛋白的特征結合域，即在第15位氨基酸和120位氨基酸之間存在2個HTH DNA-binding結構域，此結構域具有序列特異性，約由55個氨基酸構成，含有高度保守的氨基酸和間隔序列，這些保守的氨基酸可以使MYB蛋白結構域折疊成螺旋一螺旋一轉角一螺旋(helix-helix-turn-helix，HHTH)結構，以便同DNA結合，完成植物不同信號途徑下的調控功能。最后，本文利用Xbal I和Sac I對重組質粒進行酶切，回收1125bp條帶，并將其連接到pCAMBIA-S1300+載體上，通過抗性篩選和PCR檢測，證實了MpMYB30基因已經構建到植物表達載體pCAMBIA-S1300+上。深入研究MpMYB30蛋白結構，構建表達載體，將其轉入擬南芥等模式植物，驗證其調控機理，對于研究該轉錄因子在植物多種信號途徑相互作用中的調控機制，深入理解植物的逆境脅迫應答過程，從而提高植株綜合抗逆性(抗旱、抗凍、抗病及抗鹽等)具有重要意義。