苯并噻重氮對采后杧果抗病性及相關酶活性的影響

摘 要：探討了BTH(苯并噻重氮)對采后杧果(MangiferaindicaLinn，cv，HongmangN0，6)果實抗病性誘導的效果及其對幾種抗病相關酶活性的影響。用質量濃度為50mg·L^-1的BTH水溶液對杧果果實作噴霧處理后，將杧果貯藏于(20±1)℃，相對濕度為80％的恒溫箱內，觀察貯藏過程中杧果發病情況和防御酶活性的變化。結果表明，BTH處理不僅能顯著降低杧果果實自然發病的病情指數，而且明顯提高了過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PP0)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和β-1，3-葡聚糖酶(GUN)等抗病相關酶的活性。此外，BTH處理也提高了過氧化氫(H₂O₂)和總酚的含量，降低了丙二醛(MDA)的含量。因此，BTH處理提高采后杧果果實的抗病性可能是通過激活杧果的防御系統而發揮作用。

關鍵詞：杧果；苯并噻重氮；防御酶；抗病性

中圖分類號：S667.7

文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(2010)04-585-06

杧果(Mangfera indca Linn，)系世界五大熱帶水果之一，以果形美觀、色美肉甜、氣味芳香而蜚聲于世，有“熱帶果王”之稱。但杧果采后呼吸代謝旺盛，極不耐貯運是制約其發展的主要難題。由于多數杧果品種的生產期和采收期正值高溫多雨季節，因此，侵染性病害也是造成貯藏過程中經濟損失最嚴重的病害。侵染性病害中危害最大的是炭疽病(Colletotichum gloeoporioides)與蒂腐病(Phornopsis cytosporella)，這2種病菌在花期和果實發育期間便開始入侵，并在果實上保持潛伏狀態，等果實開始成熟時病菌才恢復活性，在果實表面形成大量褐色病斑，逐漸擴展變黑，最后引起全果腐爛。因此，提高杧果抗病性，減少采后病害的發生，在貯運保鮮中具有重要的意義。目前，化學農藥仍是控制果蔬采后病害的主要方法，但是長期使用化學藥劑不但使病原菌產生抗藥性，而且對環境和人體健康產生諸多負面影響。因此，有必要尋求控制果蔬采后病害的新方法。現在，人們越來越關注通過誘導果蔬自身產生抗病性來控制果蔬采后病害。

近年來剛剛開發的新型誘抗劑苯并噻重氮(benzothiadiazole，BTH)，全稱為苯基(1，2，3)-噻二唑-7-硫代羧酸硫甲酯[benzo(1，2，3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methylester，BTH]，引起了國內外學者的關注，它本身對病原菌無直接的殺菌活性，但能夠有效地活化植物的抗病防御反應，保護作物免受病毒、細菌和真菌等病原物對植物的侵害，并對植物無毒性，對環境無不良影響。據研究報道，BTH處理能夠誘導香蕉剮、桃、番茄和黃瓜等果蔬產生抗病性，有效地減輕病害的發生。但BTH應用于杧果上研究不多。我們通過探討BTH處理對杧果果實抗病性的誘導及其與細胞膜質過氧化及防御系統相關酶活性的聯系，揭示BTH控制杧果采后病害的機理，以期為尋求一種安全有效的防治杧果采后病害技術提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

本試驗采用紅杧六號杧果(Man，gifera indica Linn.cv.Hongmang No.6)作為材料，于2007年9月10日采自云南省華坪縣。采收時成熟度為七、八成熟，帶果柄采收后于9月13日運回南亞熱帶作物研究所冷庫中進行預冷。剪留果柄約1～2cm，然后選取大小均勻、無病蟲害、無機械損傷、色澤、成熟度基本一致的果實作為試驗用果。

處理時先用自來水清洗，晾干后用50mg·L^{-1BTH水溶液進行均勻噴霧處理，以自來水清洗的果實作為對照(CK)，然后晾干，再將果實放人塑料筐內，外套厚0.02mm聚乙烯薄膜袋，置于溫度為(20±1)℃、相對濕度為80％的恒溫培養箱內貯放。每個處理15個杧果，每處理重復3次。}

1.2 測定項目與方法

1.2.1 發病情況觀察及病情指數計算 病情分級標準按霍秀娟等的方法。病情按輕重分為5級：0級，不發病；1級，病斑面積占果實面積5％以下：2級，病斑面積占果實面積6％～10％；3級，病斑面積占果實面積11％～20％；4級，病斑面積占果實面積20％以上。

病情指數(disease index，DI)根據公式DI=[∑(Nx×X)×100]/(4∑Nx)計算，式中X為0～4，即發病的嚴重程度；Nx為相應級別病果的個數。

1.2.2 酶活性的測定 酶液提取：均勻稱取1g果皮，加入8mL預冷的內含1％(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的50mmol·L^-1磷酸緩沖液(pH7.8)，冰浴研磨，于4℃下12000r·FFmin^-1離心15min，取上清液用于酶活性測定。

過氧化物酶(POD)活性測定參照朱廣廉等的方法；多酚氧化酶(PPO)活性測定參照周克琴等方法；過氧化氫酶(CAT)活性測定參照曾韶西等的方法；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參考江新華舊的方法，稍有改動：取果皮組織0.5g，加8mL0.1mol·L^-1預冷的硼酸緩沖液(pH8.8)和0.02gPVF(聚乙烯吡咯烷酮)，其中緩沖液內含有5mmo1·L^-1巰基乙醇，1mmol·L^-1EDTA，冰浴研磨成勻漿，10000 r·min^-14℃離心15min，上清液即為粗酶液。反應體系中包括2mLpH 8.8的硼酸緩沖液，加4mL蒸餾水，1.0mL 0.02mol·L^-1L-苯丙氨酸，0.5mL粗酶液，對照不加酶液，改加0.5mL蒸餾水。30℃下水浴30min后，加入0.2 mL的6mol·L^-1鹽酸終止反應，于290nm波長下測光密度值。以1hD_290nm變化0.01為1個酶活力單位U。β-1，3-葡聚糖酶(GUN)活性的測定參照王金華的方法。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量的測定參照趙世杰等的方法。

1.2.4 過氧化氫(H₂O₂)含量的測定

參照鄒琦的方法。

1.2.5 總酚含量的測定 參考江新華舊的方法，稍有改動：稱取果皮0.5g加入8mL含1％HCl的甲醇液冰浴研磨后，于4℃提取24h，取1mL提取液稀釋10mL，測定D_280nm值，以D_280nm值代表總酚相對含量高低。

1.3 數據分析

采用Excel軟件以及DPS數據處理系統進行數據差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 BTH處理對杜果病情指數的影響

從圖1可以看出，BTH處理顯著降低杧果果實的病情指數(P<0.05)。貯藏16d時，BTH處理果的病情指數(33.8)比對照果(57.5)降低了23.7，降低幅度達到了41.2％，差異達到極顯著水平(P<0.01)。表明BTH處理可以顯著減輕杧果采后病害的發生。

2.2 BTH處理對杜果采后抗病相關酶活性的影響

2.2.1 對過氧化物酶(POD)活性的影響

由圖2可知，POD活性在整個貯藏過程中呈升一降一升一降的變化趨勢，第1個峰值出現在貯藏3d時，第2個峰值BTH處理果出現在貯藏7d時，而對照果出現在貯藏10d時。并且BTH處理果的POD活性高于對照果，其中貯藏前期(7d)處理果顯著高于對照果(P<0.05)。

2.2.2 對多酚氧化酶(PPO)活性的影響PPO活性變化趨勢與POD基本一致(圖3)，在整個貯藏過程中呈升一降一升一降的變化趨勢，第1個峰值出現在貯藏3d時，第2個峰值出現在貯藏10d時，并且處理果PPO活性高于對照果，其中貯藏7d和10d時PPO活性顯著高于對照果(P<0.05)。

2.2.3 對苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響 由圖4可以看出，對照果和BTH處理果PAL活性變化趨勢大體相同，都出現了2次升高的過程。在貯藏3d以前PAL活性略呈降低趨勢，以后PAL活性開始升高，第5天出現峰值后又降低，BTH處理果在貯藏7d時降到最低，然后又迅速升高，而對照果在貯藏10d時降到最低后又略有升高。經方差分析，BTH處理果PAL活性在貯藏7d時顯著低于對照果(P<0.05)，在貯藏12d時極顯著高于對照果(P<0.01)。這表明了BTH處理提高了，杧果果實貯藏后期PAL的活性。

2.2.4 對β－1，3－葡聚糖酶(GUN)活性的影響從圖5可看出，BTH處理果和對照果的GUN活性變化趨勢大體一致，在貯藏5d時2者的GUN活性都開始迅速升高，并分別在貯藏7d時和10d時達到各自的峰值后又降低，BTH處理果早于對照果3d達到峰值，而且其峰值高于對照果。表明BTH處理誘導了杧果貯藏中期GUN活性的升高。

2.2.5 對過氧化氫酶(CAT)活性的影響

過氧化氫酶(CAT)的活性如圖6所示，對照果CAT活性在貯藏前期逐漸降低，7d后迅速上升，貯藏12d時達到最大(14.89U·g_{-1)；而BTH處理果CAT活性在貯藏前5d逐漸降低，然后迅速升高，7d時達到最大值后又逐漸降低。僅在貯藏7d和10d時，其CAT活性高于對照果，其中貯藏7d時與對照相比差異達到顯著水平(P<0.05)。可見，BTH處理可以提高杧果果實貯藏中期的CAT活性。}

2.3 BTH處理對市杧果過氧化氫(H₂O₂)、總酚和丙二醛(MDA)含量的影響

從圖7可見，對照果H₂O₂含量在貯藏前期是緩慢降低的，在10d后略有升高。而BTH處理果H₂O₂含量在貯藏前3d是降低的，然后逐漸升高至10d達到峰值，然后又有所降低。在貯藏中后期(7d和10d)BTH處理果H₂O₂含量顯著高于對照果(P<0.05)。表明BTH處理提高了采后杧果果皮中H₂O₂的含量。

從圖8可以看出，BTH處理以后，杧果果皮中總酚的含量變化趨勢與對照并不一致。對照果總酚含量在貯藏初期降低，3d后有所升高，然后基本保持不變。而BTH處理果總酚含量逐漸降低至第5天后又迅速升高，貯藏7d時達到峰值后又迅速降低，最后又略有升高。其中在貯藏7d時，BTH處理果總酚含量顯著高于對照果(P<0.05)。

從圖9可見，在整個貯藏過程中，對照果和BTH處理果MDA活性變化趨勢基本一致，MDA含量呈逐漸升高的變化趨勢，并且BTH處理果MDA含量在整個貯藏期間均低于對照果，但與對照相比差異不顯著。

3 討論

新型誘抗劑苯并噻重氮(BTH)本身沒有抑制微生物生長的活性，但外源施用BTH能夠使植物產生系統獲得性抗性。本試驗結果表明，50mg·L^-1BTH處理對控制杧果采后病害的產生有明顯的效果，顯著降低了杧果果實的病情指數，有效減少了卡亡果采后腐爛，延長了貨架期。這與王金華和麻寶成等在香蕉果實上的研究結果相似。

在經過誘導的免疫植株中，可檢測到有新的蛋白質出現，它們被稱為病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins，PRP)。病程相關蛋白包括幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶和過氧化物酶等。外源施用BTH可激活病程相關蛋白基因的表達，并由此提高植物抗病性，抵抗許多不同的病原菌的侵襲。本研究表明，BTH處理誘導了杧果病程相關蛋白β-1，3-葡聚糖酶(GUN)和過氧化物酶(POD)活性的提高，誘導了杧果的系統獲得性抗性，從而控制了病害的發生。

本試驗中，BTH處理的杧果CAT、PPO、PAL等防御酶的活性提高，表明這些酶也與杧果的抗病性有關，這與前人分別在香蕉、桃和梨上的研究結果一致。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關鍵酶和限速酶，經由該途徑合成的中間產物如酚類物質都是植物體內的一些重要抗菌物質；PPO可將酚類物質氧化成高毒性的醌類物質從而可對人侵病原物進行毒殺；CAT定位于過氧化氫體中，對過氧化氫體中的H₂O₂有清除作用，其他部位的H₂O₂也可擴散到過氧化氫體中被CAT清除。CAT活性升高對減少早期H₂O₂積累有一定促進作用。近年來，H₂O₂作為植物中新的信號分子的發現，使H₂O₂與植物抗病性的研究成為新的熱點。目前，人們對活性氧與抗病防衛反應信息傳遞的關系有兩種解釋，一種觀點認為細胞代謝產生的H₂O₂，直接作為二級信使參與植物抗病防衛反應；另一種觀點認為細胞產生的活性氧通過引起膜脂過氧化，產生某些不飽和脂肪酸的過氧化物作為信號分子，激活植物的各種防衛反應。在本試驗中，發病較遲且病情發展緩慢的BTH處理果H₂O₂含量在貯藏中后期明顯高于對照。表明較高的H₂O₂水平有利于采后杧果果實抵抗病菌的侵染，推測可能作為信號分子在其誘導抗病過程中起著重要的作用。

酚類化合物是各種植物體內重要的次生代謝物質。其中許多具有抗菌活性，能殺死細胞，同時也能殺死侵染的病原物，產生過敏反應，酚氧化后形成毒性更強的醌類，在植物的防御機制中起著重要作用，此外，酚類物質還是合成木質素、植保素等抗病物質的前體。黃婭琳認為可以將酚類物質作為一個抗病指標。本試驗結果表明，在貯藏7d時，BTH處理果的總酚含量出現一個峰值，明顯高于對照，可能對杧果果實后期病情發展緩慢起到了積極的作用。這一結果與王金華在香蕉上的研究結果相類似。

果實在逆境脅迫或衰老過程中，會活化細胞內的氧代謝，產生對細胞有害的活性氧。活性氧會引起細胞膜發生膜脂過氧化作用，導致細胞膜功能的喪失和細胞膜組織結構的解體。丙二醛(MDA)作為膜脂過氧化作用的最終產物，它的含量是膜脂過氧化程度的一個重要標志。在植物感病后的抗病反應中，高水平積累的活性氧可直接攻擊膜系統的不飽和脂肪酸，導致膜脂過氧化的發生，表現為MDA的積累。本研究發現，BTH處理能夠抑制貯藏期間杧果果實MDA含量的上升，降低膜脂過氧化的程度，這很可能與BTH處理提高杧果抗病性有關。

4 結論

BTH處理誘導了杧果果實POD、CAT、PPO、PALβ-1，3-葡聚糖酶(GUN)等防御酶活性的增加，加強了采后杧果果皮中的活性氧代謝，通過誘導提高果實抗病信號分子H₂O₂的積累水平，降低MDA的含量，使果實產生系統獲得抗性，有利于抑制病原菌和減輕病害的發生。BTH處理激發了采后杧果的抗病潛能，從而使其表現出一定程度的抗病性。