4個石榴基因型的SRAP鑒定

摘 要：為了便于對生產上主要推廣的4個石榴(PunicagranatumL)基因型進行苗木純度檢測，維護育種者和果農的利益，用225對SRAP(sequeneeRelatedAmplified P0lvmorphism)引物組合對其幼嫩葉片DNA進行了分析。結果發現其中19對SRAP引物組合的23個差異遷移位點的擴增條帶穩定、清晰，可以將4個石榴基因型完全區分開，作為其鑒別的標記。將這些條帶進行數據化記錄和分析，發現僅用ME8／EMII和ME9／EMl8位點的共計3個差異遷移位點的數據即可將供試的4個材料區分開。將這些數據輸入Excel數據表格，獲得了由系統自動生成的4個石榴基因型“分子身份證”號碼，可作為這4個石榴基因型間的鑒定依據。

關鍵詞：石榴；SRAP；分子標記；品種鑒定；分子身份證

中圖分類號：S665.4 文獻標識碼：A 文章編號：(1009～9980(2010)04-631-05

石榴(Punica granatum L.)為石榴科(安石榴科)(Punicaceae)石榴屬(Punic。L.)落葉灌木或小喬木。石榴果實營養成分豐富，除鮮食外，還可加工成果汁、酒、露等，發展前景廣闊。近幾年，石榴種植面積迅速擴大，苗木品種混雜現象特別嚴重，給生產造成了極大的昆亂。進行品種鑒定，確保品種的真實性和純度，對加快石榴良種化進程，促進產業發展，維護育種者和生產者的利益具有重要意義。

分子標記技術的發展為果樹品種鑒定提供了更為快速準確的途徑。SRAP(sequence-related ampli-fied po1vmorphis)是一種新型的基于PCR的標記系統，其上游引物核心序列為“GGCC”，下游引物核心序列為“AA33\"”，反映的是不同基因型啟動子、內含子和間隔序列間的長度多態性，是一種顯性標記系統。SRAP技術因其簡單、快速、穩定性強，無需預知序列信息、多態信息含量豐富等優點，反應體系已在柑橘、荔枝、櫻桃、柿子、龍眼、石榴等果樹中建立并得到廣泛應用。昝逢剛等用22對SRAP引物研究荔枝種質遺傳多樣性，產生的多態性條帶占總帶數的97.73％。李莉等㈣利用19對SRAP引物對26份棗材料進行研究，結果發現多態率達到98.28％。張春雨等利用SRAP技術研究新疆野蘋果遺傳多樣性，發現多態率為98.58％。張四普等利用7對SRAP引物對23個石榴基因型遺傳多樣性進行了分析，共擴增出1380個條帶，其中多態性條帶為662個，多態率為48％；鑒于其電泳檢測用的是分辨率較低的瓊脂糖凝膠，而非聚丙烯酰胺凝膠，實際的多態率可能會高一些，SRAP技術應該可以用于石榴的遺傳多樣性和分子身份識別系統的研究。

突尼斯軟子石榴是河陰石榴產區目前的石榴主栽品種，中農紅軟子石榴、紅如意軟子石榴和中農黑子甜石榴則是該區比較有發展前景的幾個石榴基因型。近年來，這4個石榴基因型每年投入市場的苗木數量巨大(僅突尼斯軟子石榴和中農紅軟子石榴每年投入市場的苗木數量就超過100萬株)，相互混雜、抵充的現象時有發生。筆者利用SRAP標記對這4個發展潛力巨大的基因型進行鑒定，并利用Excel

建立這4個基因型的分子身份識別系統，以期為石榴種質的分子鑒定提供借鑒，為凈化石榴苗木市場盡綿薄之力，并為在更大的范圍內建立石榴的分子身份識別系統做一些有益的嘗試。

1 材料和方法

1.1 材料

所用材料為中農紅軟子石榴、紅如意軟子石榴、突尼斯軟子石榴、中農紅黑子甜石榴等4個石榴基因型的葉片，葉片由1a生休眠枝在光照培養箱中水培獲得，枝條于2009年3月10日取自中國農業科學院鄭州果樹研究所石榴資源圃。

1.2 儀器和設備

實驗使用的主要儀器有：電泳儀(北京六一，DYY-12)，高速冷凍離心機(Hettich.MICRO 200R)，-凝膠成像系統(培清，JS 680B)，PCR儀(Bjo-Rad.S1000)，核酸蛋白分析儀(Eppendorf.BioPhotome－ter)，移液器(Eppendorf.Research)，冰箱(海爾，BCD-215YD E)。

1.3 引物和試劑

選取已公布的SRAP上、下游引物各15條，組成225對引物組合，由上海賽百勝生物有限公司合成。引物名稱及序列見表1。所用試劑除Taq酶購自Takara外，其余試劑均購自鄭州奧瑞吉生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 DNA提取采取微量CTAB法。

1.4.2 SRAP擴增 SRAP擴增總體系為10 uL。其中10×buffer(Mg²⁺free)1uL，Mg²⁺2mmol·L^-1，dNTPmixture 0.8 mmol·L^-1，上下游引物各0.2umol·L^-1，DNA模板為60ng，TaqDNA聚合酶0.6u。擴增程序是：95℃變性5min；95℃1min.35℃ 1 min，72℃1 min，5個循環；95℃1 min，50℃1 min，72℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸5min。

1.4.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳取2.5uL的擴增產物，在300V電壓下電泳1.5h，銀染后照相記錄。

1.4.4 數據記錄 選擇在4個石榴品種中表現出明顯差異的遷移位點進行記錄，根據條帶的有無分別記做“1”和“0”。

1.4.5 石榴品種分子身份識別系統數據表建立 按照擴增條帶穩定清晰、多態信息含量豐富、區分度高的原則，選擇可將4個石榴品種完全區分開的引物組合，將其差異遷移位點特征條帶的數據輸入Excel表格，建立石榴分子身份識別系統。表格的字段由品種名稱、分子身份編號和特征條帶構成，其中特征條帶字段數目由差異遷移位點數目決定，而品種的分子身份編號則由特征條帶各字段的數據按照字段順序由系統自動生成。而數據查詢則可方便地利用Excel數據表格“編輯(E)”菜單中的“查找(F)”功能實現。若需要對品種進行介紹或標注，還可以增加諸如備注等新的字段。

2 結果與分析

2.1.4 個石榴品種的SRAP擴增結果

在4個石榴基因型中，中農紅軟子石榴分別在ME1/EM17位點的200、400 bp處，ME1/EM18位點的600bp處，ME7/EM9位點的150bp處，ME7/EM19位點的300 bp處，ME16/EM5位點的150 bp處，MEl6/EMl9位點的200 bp處有帶，除ME1/EM17位點的200 bp處條帶外，其余條帶均可作為其區別于中農紅軟子石榴的特征帶。

紅如意軟子石榴分別在ME16/EM14，ME16/EM12、ME8/EM9

ME9/EM19

ME16/EM16

ME8/EM11和ME8/EM13等位點400、350、310、300、500、400、470bp處有特異擴增條帶；在ME7/EM9、ME7/EM19、ME16/EM5、ME16/EM19、ME1/EM17等位點的150、300、150、200、400 bp無條帶，這些可以作為紅如意軟子石榴與其他3個石榴基因型區分的標記。

突尼斯軟子石榴分別在ME1/EM18、ME3/EM1和ME8/EM11引物位點的280、230、120 bp處有特異擴增條帶：在ME1/EM17、ME8/EM16位點的150、200 bp處缺失條帶，可以作為突尼斯軟子石榴與其他3個石榴基因型區分的標記。

中農黑子甜石榴在ME9/EM18位點的680 bp處有特異條帶，在ME17/EM2位點的450bp處缺失條帶，可以作為中農黑子甜石榴區別于其他3個石榴基因型的標記。此外，中農黑子甜石榴和中農紅軟子石榴在ME1/EM18位點的600 bq處有條帶，在ME2/EM15位點的280bp處無條帶，這些也可以作為中農黑子甜石榴和中農紅軟子石榴與另外2個石榴基因型區分的標記。部分引物位點的電泳圖見圖1。

2.2 石榴品種分子身份識別系統建立

經過篩選，僅用ME8/EM11和ME9/EM18等2個引物組合進行SRAP擴增即可將供試的4個石榴基因型分開。將4個石榴基因型在ME8/EM11位點280 bp和460 bp處的數據、ME9/EM18位點680 bp處的數據和ME7/EM19位點300 bp處的數據輸入Excel數據表格，即獲得了含有系統自動生成的4個石榴基因型分子身份編號的石榴分子身份識別表(表2)。該表信息含量豐富，簡潔明了，品種(基因型)名稱和分子身份編號相對應，并且包含了引物組合信息和遷移位點條帶大小信息，可方便地應用于石榴分子鑒別。

3 討論

傳統的形態學方法進行品種鑒定往往主觀因素影響較大，不夠準確，而且苗期往往不容易鑒定，周期較長。DNA分子標記反應的是基因組水平的內在遺傳信息，進行品種鑒定可以不受環境條件的影響，可以大大提高鑒定的準確性和效率。截至目前，應用分子標記指紋圖譜技術進行品種鑒定的報道已經很多，但多數仍然使用的是早期的特征譜帶法，比對過程卻仍然屬于效率低下的手工勞動過程，鑒定的品種多了便出現弊端。從長遠看，利用相對比較大的品種群體從一批引物中篩選出部分穩定、清晰、多態信息含量足夠豐富的核心引物㈣，構建一套通用性好、穩定、準確的品種分子身份識別系統，將可方便地進行品種鑒定和雜種后代鑒定，極大地節約人力、物力和財力投入。研究僅從近期需要出發鑒定了4個在生產上發展潛力較大、市場上苗木數量較多的石榴新品種，似乎除了嘗試并無建立分子身份證的必要，但若建立了分子身份證，將來要從該4個品種中鑒定其中之一，僅需要對這一個品種依既定引物順序擴增、記錄后進行查詢即可，無需再與其余3個品種的指紋圖譜進行比對，高效而又經濟，這就是構建品種分子身份識別系統的意義所在。

已有的建立品種分子身份證的報道多采用共顯性的SSR標記，如張彥等舊利用10對SSR引物對21個水稻材料進行分子指紋分析，并將結果數據化為相關水稻材料的分子身份證號碼。艾呈祥等從38對SSR引物中篩選出僅有2個等位基因，能夠擴增出穩定帶型且不同材料之間差異明顯的10對引物對24個甜櫻桃品種進行分子指紋分析，并將結果數據化為甜櫻桃品種的分子身份證號碼。高運來等舊以黑龍江83份大豆品種為材料，43對SSR引物中篩選出9對引物構建了一套黑龍江省大豆品種的分子身份證。本研究利用顯性的SRAP標記嘗試構建了石榴品種的分子身份識別系統。與共顯性標記相比，利用顯性標記構建品種的分子身份識別系統需要選擇穩定而易于辨認的特定遷移位點的等位基因(allele)進行記錄，而非對同一位點的所有等位基因都進行記錄。在數據記錄上也僅區分“有”和“無”，分別用“1”和“0”賦值。假設記錄n個等位基因，且不排除某一品種在所有等位基因位點均無產物的情況，那么總共可以區分的品種就是2n個。若按照國內目前不到300份的石榴品種資源保有量計算，理想狀況下僅需篩選9個等位基因的數據就足以將所有資源區分開。研究所建立的石榴分子身份識別系統只采用了3對引物組合的4個差異遷移位點的數據，用于在供試4個基因型之中進行精確鑒定；鑒于SRAP豐富的多態性，若要將鑒定擴大到更多的石榴基因型上，在更大范圍的石榴群體中進行SRAP標記的篩選，對該系統進行相應的數據補充應該也是可行的(目前這部分工作正在進行中)。

此外，在多數構建品種分子身份識別系統的研究中，均采用或開發特定的程序軟件來管理數據。本研究將數據直接輸入Excel，利用Excel自帶的函數可方便地編程，實現分子身份識別系統所需功能，也完全能夠滿足數據管理的需要。而Excel本身的數據容量、簡易高效的編程實現能力，足以滿足石榴等樣本較小的樹種構建分子身份識別系統的需要，可以省卻大量的編程工作量。

4 結論

SRAP標記能夠用于石榴品種的分子鑒定，研究從19對SRAP引物組合擴增出的23個穩定、清晰的差異遷移位點中僅用ME8/EM11和ME9/EM18引物組合的共計3個差異遷移位點的數據即可以將中農紅軟子石榴、紅如意軟子石榴、突尼斯軟子石榴、中農紅黑子甜石榴等4個石榴基因型完全區分開。把這些數據輸入Excel數據表格，獲得了由系統自動生成的4個石榴基因型“分子身份證”號碼，表明SRAP技術可以用于構建石榴的分子身份識別系統，