梨遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及部分果實(shí)性狀QTL的定位

摘 要：利用八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F₁。代實(shí)生苗為作圖群體，應(yīng)用J0inmap 3.0作圖軟件，構(gòu)建了一張包含61個蘋果EST—SSR標(biāo)記、68個蘋果SSR標(biāo)記、49個梨SSR標(biāo)記、1個RAPD標(biāo)記和3個質(zhì)量性狀標(biāo)記，共182個標(biāo)記并分屬于19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜，圖譜總長度為982cM，標(biāo)記間平均圖距5.4cM。控制果皮紅色的基因RFS位于LG3連鎖群上，與最近的分子標(biāo)記MES93-264p的遺傳距離分別為9cM。控制果銹存在的基因FR、控制萼片脫落性狀的基因As分別位于LGl6連鎖群和LGl2連鎖群上。采用區(qū)間作圖法，檢測到與果實(shí)可溶性固形物含量、單果質(zhì)量、橫徑和縱徑等性狀連鎖的QTL位點(diǎn)21個(LOD≥2.5)，其中主效QTL位點(diǎn)6個(LOD≥3.5)，與果實(shí)性狀相關(guān)QTL位點(diǎn)多集中在LG7和LGll連鎖群上。

關(guān)鍵詞：梨；SSR；EST—SSR；遺傳圖譜；QTL分析；果實(shí)性狀

中圖分類號：S661-2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009—9980f2010104—496—08

梨(Pyrus L)是中國重要的果樹之一，其栽培面積和產(chǎn)量僅次于柑橘和蘋果，位居第3位。為了梨產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，培育品質(zhì)好和抗性強(qiáng)等綜合性狀優(yōu)良的新品種非常必要。由于梨的童期較長。利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)選育新的品種需要很長的時間。利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種技術(shù)無疑可以提高選擇效率，加快育種步伐。而高質(zhì)量的遺傳連鎖圖譜可以進(jìn)行基因定位、檢測和分析數(shù)量性狀的位點(diǎn)(QTLs)，是MAS的基礎(chǔ)。

目前，有關(guān)梨遺傳圖譜的構(gòu)建的研究主要集中在西洋梨和日本梨上。已經(jīng)在巴梨(Bartlett)、幸水梨(Kousui)、巾著梨(Kinchaku)和豐水梨(Housui)等品種上建立了遺傳連鎖圖譜。但早期構(gòu)建的所用的F₁群體較小，所構(gòu)建的連鎖群大于梨的染色體基數(shù)17。Yamamoto等構(gòu)建的Bartlett遺傳圖譜由447個標(biāo)記，17個連鎖群構(gòu)成，圖譜總長1 000 cM。Terakami等整合構(gòu)建了豐水梨遺傳圖譜，覆蓋梨基因組1174cM，由17個連鎖群，335個標(biāo)記構(gòu)成，分子標(biāo)記之間的平均距離為3.5cM。

梨多數(shù)重要性狀特別是與果實(shí)品質(zhì)有關(guān)的性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀(QTL)，但目前有關(guān)梨QTL定位的報道很少，在其他果樹，關(guān)于果實(shí)的QTL定位已經(jīng)取得了部分成果。Wang等對控制櫻桃的單果質(zhì)量和可溶性固形物的QTL位點(diǎn)進(jìn)行了定位。King等發(fā)現(xiàn)與蘋果果實(shí)硬度相關(guān)的QTL位點(diǎn)分別分布在7個連鎖群上。Didewanger等對桃果實(shí)質(zhì)量量、可溶性固形物的含量、果實(shí)糖含量、果實(shí)pH、可滴定酸含量等進(jìn)行了定位，發(fā)現(xiàn)具有相關(guān)功能的QTL位點(diǎn)成簇分布。

我國梨遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位的研究起步較晚，到目前為止，僅有孫文英等用鴨梨和京白梨的₁，群體建立了主要由AFLP標(biāo)記組成的梨遺傳圖譜和對與梨生長性狀相關(guān)的QTL進(jìn)行的定位。針對目前關(guān)于梨果實(shí)QTL定位研究的空白，更好地從分子水平上研究梨果實(shí)數(shù)量性狀位點(diǎn)遺傳規(guī)律，我們利用包括自行開發(fā)的蘋果EST-SSRtnl等在內(nèi)的蘋果及梨的多種SSR標(biāo)記，利用在果實(shí)性狀上存在較大差異的八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F₁群體構(gòu)建梨分子標(biāo)記連鎖圖譜，對控制梨果實(shí)質(zhì)量性狀的基因進(jìn)行了定位，并采用MapQTL4，0軟件，選用區(qū)間作圖法(interval mapping)對控制可溶性固形物含量、單果質(zhì)量、橫徑、縱徑的4種果實(shí)性狀的OTL進(jìn)行了分析和定位。

1 材料和方法

1.1 材料

以八月紅梨為母本、碭山酥梨為父本雜交得到的91株F₁為作圖群體。雜交群體種子于2001年春天在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所播種，2005年結(jié)果，2006—2007年對果實(shí)的著色、單果質(zhì)量(Mass of single fruit，MSF)、橫徑 (Transverse diameter 0f fruit，TDF)、縱徑(Vertical diameter of fruit，VDF)、可溶性固形物含量(Total soluble solids concentra-tion，SSC)進(jìn)行連續(xù)2a的測定。

1.2 總DNA的提取

于2008年采集雜交群體及親本的新鮮幼葉，用改良SDS法提取基因組DNA。

1.3 SSR引物的篩選和分析

研究共選用了154對引物，其中80對為蘋果基因組SSR引物，34對為梨基因組SSR引物，40對為本研究小組基于蘋果EST庫開發(fā)，且證明在梨屬上具有轉(zhuǎn)移性和多態(tài)性良好的EST-SSR引物。PCR反應(yīng)體系為20μL，組分及濃度分別為：1 xPCR buffer，1.5mmol·L^-1MgCl₂0.2 mmol·L^-1dNTPs，0.5mmol·L^-1上下游引物，0.5mg·L^-1模板DNA，0.05U·μL^-1Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序參照原文獻(xiàn)。選取2個親本進(jìn)行154對引物的初步篩選，在親本中有多態(tài)性的引物用于整個F1代群體中進(jìn)行擴(kuò)增。一部分SSR擴(kuò)增產(chǎn)物用傳統(tǒng)聚6％變性丙烯酰胺凝膠電泳并進(jìn)行銀染㈣，以已知分子量marker(PBR322／Msp I marker)估算每條譜帶的分子量。另一部分標(biāo)記通過合成熒光引物，上游引物為普通引物，下游引物加入了熒光染料(FAM或者HEX)，擴(kuò)增產(chǎn)物用雙蒸水稀釋到合適的濃度，在浙江大學(xué)分析測試中心，以Marker ET550-R為標(biāo)準(zhǔn)，使用MegaBACE 1000 DNA測序儀(Amersham Bio—sciences)測定產(chǎn)物片斷大小，測序結(jié)果使用軟件Genetic Proffer 2.0進(jìn)行分析。

1.4 RAPD引物篩選和分析

選取S519、S1289、S2107和S12354個RAPD引物，PCR反應(yīng)體系和程序參照原文獻(xiàn)。PCR反應(yīng)物經(jīng)2，5％瓊脂糖膠(EB 0.5mg·L^-1)電泳檢測，電壓為4～5V·Cm^-1，以已知分子量(marker Gene Ruler100bp DNA ladder plus)估算每條譜帶的分子量，紫外透射反射分析儀上觀察照相。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖譜構(gòu)建

使用SPSS軟件計算單果質(zhì)量、橫徑、縱徑和可溶性固形物含量4個性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、偏態(tài)值和峰度值以及4個性狀之間的相關(guān)性。對RAPD、SSR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，有帶(峰)的記為1，無帶(峰)的記為0，缺失的記為一，采用“引物組合+分子量”表示，后綴P、m、f分別表示父母共同帶、母本特征帶、父本特征帶。把果皮紅色性狀(red fruit skin，RFS)、有果銹(fruit russeting，F(xiàn)R)、萼片脫落性狀(abscis—sion 0f sepals，AS)分別看作一個形態(tài)學(xué)標(biāo)記，用“1”表示，相對應(yīng)地將果皮非紅色，無果銹，以及萼片宿存或殘存的性狀記作“0”。按照J(rèn)oinMap 3.0軟件對數(shù)據(jù)格式的要求將原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行統(tǒng)一轉(zhuǎn)換，計算連鎖群體。結(jié)合MapQTL 4.0軟件進(jìn)行區(qū)間作圖，進(jìn)行數(shù)量性狀的QTL定位，將LOD≥2.5作為QTL位點(diǎn)的入選臨界值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR的多態(tài)性分析

研究共篩選出92對引物，包含了28對蘋果EST-SSR引物、43對蘋果SSR引物、21對梨SSR引物，共產(chǎn)生197個等位基因，平均每條引物產(chǎn)生2.1個等位基因，對這些多態(tài)性位點(diǎn)的標(biāo)記分離比例進(jìn)行統(tǒng)計，共有25個等位基因表現(xiàn)為偏孟德爾分離(X²<0.01)，頻率為12.69％，其中嚴(yán)重偏分離標(biāo)記沒有用于連鎖群體的構(gòu)建。

2.2 梨遺傳圖譜的構(gòu)建

利用Joinmap 3.0作圖軟件分析分子標(biāo)記的分離比例并進(jìn)行標(biāo)記之間的連鎖分析，構(gòu)建了一張共包含182個標(biāo)記的的梨后代遺傳圖譜，其中包含了61個蘋果EST-SSR標(biāo)記、68個蘋果基因組SSR標(biāo)記、49個梨基因組SSR標(biāo)記、1個RAPD標(biāo)記，3個質(zhì)量性狀標(biāo)記，分屬19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜(圖1)。各連鎖群的LOD值在3.0～8.0，圖譜總長度覆蓋梨基因組982cM，各連鎖群標(biāo)記間平均距離在2.6～9.7cM，整個連鎖群的平均距離為5.4cM；各連鎖群的長度在30～76cM。其中LGl9最短，LGll最長；不同連鎖群上的標(biāo)記數(shù)在6～14個，其中7個連鎖群所含標(biāo)記數(shù)目大于10個。

2.3 果皮紅色·陛狀、果銹及萼片脫落，宿存性狀的定位

在91株后代群體中，71.4％個體的果皮表現(xiàn)為非紅色，28.6％個體的果實(shí)表現(xiàn)為紅色，卡方檢驗(yàn)X²0.619(X²0.05=3.841，X²20.05)，符合3:1的分離比例；47.2％個體的果實(shí)表現(xiàn)為有果銹，52.8％的個體的果實(shí)表現(xiàn)為無果銹，卡方檢驗(yàn)X²=0.275(x²=3.841，Xx²20.05)符合1:1的分離比例；77.7％個體的萼片表現(xiàn)為脫落，22.2％個體的表現(xiàn)為萼片宿存或殘存，卡方檢驗(yàn)X²=0.443(x²0.05=3.841，x²20.05)，符合3:1的分離比例。該F₁。代雜交群體中這3種性狀均表現(xiàn)為孟德爾單基因遺傳規(guī)律，可進(jìn)行圖譜定位分析。

如圖1所示，控制果皮紅色的基因RFS位于連鎖圖第3連鎖群上，并與標(biāo)記S519以及MES₉₃264p相連鎖，遺傳距離分別為10cM和9cM：控制果銹有無的基因FR位于連鎖圖第16連鎖群上，并與標(biāo)記CH01H01-107p連鎖，遺傳距離為5cM：控制萼片脫落與宿存性狀的基因AS位于連鎖圖第12連鎖群上，并與標(biāo)記CH02F06-195m連鎖，遺傳距離為4cM。

2，4 果實(shí)性狀在F_１。群體中分離與相關(guān)性分析

研究所選親本在果實(shí)外形和品質(zhì)等方面有著一定的遺傳差異，通過對91株雜交后代的分離性狀分析表明：可溶性固形物含量、單果質(zhì)量、橫徑和縱徑4個性狀均為連續(xù)分布，其平均值、峰度、偏度檢測如表1所示，各個性狀的頻率分布如圖2，基本接近正態(tài)分布，可用作QTL定位研究。分析表明這4個性狀的峰值數(shù)值較小，均非常接近0.5；4個果實(shí)性狀在作圖群體中兩兩之間均表現(xiàn)出了極顯著的相關(guān)性，正相關(guān)系數(shù)r=0.956^**～0.992^**(**表示在1％的概率水平上有極顯著相關(guān)性)。

2.5 果實(shí)性狀QTL的定位

采用MapQTL4.0軟件，選用區(qū)間作圖法對控制可溶性固形物含量(SSC)、單果質(zhì)量(WSF)、果實(shí)橫徑(TDF)、果實(shí)縱徑(VDF)的QTL進(jìn)行了分析。通過分析共檢測到21個QTL，分別被定位在9個連鎖群上(圖1)，其中主效QTL位點(diǎn)有6個(LOD≥3.5)。其QTL在連鎖群上的分布見表2。

定位結(jié)果顯示，控制單果質(zhì)量、橫徑、縱徑、可溶性固形物含量的QTL位點(diǎn)主要集中在7號、11號、16號連鎖群上，并且相距很近或重疊的較多。在LG7中，共有7個QTL位點(diǎn)，其中控制單果質(zhì)量、橫徑和縱徑分別有2個、2個和3個QTL位點(diǎn)。WSF-1和VDF-1兩個QTL位點(diǎn)接近，并且與MES₄₆-115f表現(xiàn)為共分離，這些結(jié)果表明單果質(zhì)量的增加主要取決于果實(shí)橫徑和縱徑的增加，橫徑和縱徑對單果質(zhì)量的貢獻(xiàn)都很大。在11號連鎖群上共有5個QTL位點(diǎn)，其中控制單果質(zhì)量、橫徑、可溶性固形物含量的QTL位點(diǎn)相近或重疊的較多，TDF-4和SSC-4兩個QTL位點(diǎn)是重疊的，與最近的分子標(biāo)記距離為3.2cM，QTL位點(diǎn)的相關(guān)性說明可溶性固形物含量與單果質(zhì)量性狀之間有一定的相關(guān)性。在2號連鎖群上，檢測到TDF-1和SSC-1兩個QTL位點(diǎn)相距很近，它們與最近的分子標(biāo)記CH02810-110f的距離都是1.2cM和1.7cM。

在7號、11號、14號連鎖群上分別檢測到1個控制單果質(zhì)量的主效QTL，LOD值分別為4.19、3.93、3.54，可解釋分別為33.1％、30.6％、26.6％的表型變異，與最近的分子標(biāo)記的距離分別在0.4cM～3.8cM。在11號連鎖群上，檢測到一個與Hi22f06-229f共分離的控制單果質(zhì)量的微效QTL，可解釋16.7％的表型變異。

在2號連鎖群上，檢測到一個控制橫徑的主效OTL位點(diǎn)TDF-1，LOD值為3.60，可解釋26.2％的表型變異，與最近的分子標(biāo)記的距離CH02810-110f為1.2cM。在7號連鎖群上檢測到1個控制縱徑的主效QTL位點(diǎn)VDF-2，LOD值為3.88，可解釋24.0％的表型變異，與最近的分子標(biāo)記的距離為5.0cM。在10號連鎖群上檢測到1個控制可溶性固形物含量的QTL位點(diǎn)SSC-3，LOD值為4.50，可解釋22.7％的表型變異，與最近的分子標(biāo)記的距離CH04c07-150m為5.0cM。

另外檢測到控制單果質(zhì)量、橫徑、縱徑、可溶性固形物含量的其他15個QTL位點(diǎn)的LOD值均沒有達(dá)到3.5，可解釋表型變異相對較小，認(rèn)為是微效QTL位點(diǎn)，它們與最近標(biāo)記的距離在0.4～5.0cM。

3 討論

3.1 對所構(gòu)建的梨遺傳圖譜的分析評價

研究利用Joinmap3.0作圖軟件構(gòu)建了一張分屬19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜。從總體來看，所構(gòu)建的圖譜各標(biāo)記分布比較均勻。在構(gòu)建的遺傳連鎖圖上，部分SSR標(biāo)記的連鎖群分布以及在連鎖群上的排列次序與Yamamoto等、MaIiepaard等和Liebhard等發(fā)表的蘋果遺傳圖譜是一致的，各標(biāo)記間的遺傳距離由于作圖群體和作圖軟件等不同而存在差異。

分子連鎖群是植物染色體在分子水平上的反映。理論上，分子連鎖群的數(shù)目應(yīng)該和相應(yīng)染色體的數(shù)目一致。梨為二倍體，染色體數(shù)目X=17，而本研究所構(gòu)建的連鎖群體有19個。在其他研究者構(gòu)建的梨遺傳圖譜上也有類似問題。如Yamamoto等構(gòu)建的Bartlett圖譜有18個連鎖群。Iketani等引在日本梨Kinchaku和Kosui上分別構(gòu)建了含有18個和22個連鎖群的遺傳圖譜。造成這種狀況的主要原因有以下幾點(diǎn)：第一。所選用的分子標(biāo)記在染色體上分布的隨機(jī)性以及染色體不同區(qū)段交換值異質(zhì)性的存在，導(dǎo)致連鎖群斷開；第二，該選用的標(biāo)記數(shù)目太少，尚未完全覆蓋整個梨的基因組；第三，在構(gòu)建圖譜時，對于卡方測驗(yàn)偏離1:1或3:1以及缺少15％以上株系數(shù)據(jù)的SSR標(biāo)記均未使用。

SSR標(biāo)記呈共顯性，在基因組中含量豐富，可作為錨定標(biāo)記，有助于圖譜連鎖群的歸并和不同連鎖群的整合。本研究小組首次將自行開發(fā)的蘋果EST-SSR引物成功地定位到了梨的圖譜上。目前國外雖構(gòu)建了梨的連鎖圖但尚未建立公共圖譜，無公共的標(biāo)記可利用，所以己構(gòu)建的這些連鎖群和17條染色體不能一一對應(yīng)，因此今后為了構(gòu)建高密度的遺傳圖譜，應(yīng)當(dāng)與其他多種分子標(biāo)記手段相結(jié)合，完善遺傳圖譜。

3.2 關(guān)于果皮紅色性狀標(biāo)記的定位

目前，還沒有關(guān)于梨果皮紅色性狀標(biāo)記的定位。在本研究中，我們將控制果皮紅色的性狀標(biāo)記RFS定位于第3連鎖群上，并與標(biāo)記S519以及MES93-264p相連鎖，遺傳距離分別為10cM和9cM。Weeden等的研究認(rèn)為，果樹上控制果皮中花青苷合成的基因位于第3連鎖群上。本研究將控制果皮顏色的基因RFS位于連鎖圖第3連鎖群上，與控制果皮中花青素的基因在同一連鎖群。

目前在蘋果上，已經(jīng)尋找到與果皮紅色基因相連鎖的分子標(biāo)記。Cheng等獲得了與蘋果果皮色澤相關(guān)的分子標(biāo)記，并且也開發(fā)出一對通用性PCR引物。趙靜等圳在蘋果中發(fā)現(xiàn)S519在1000bp左右可以擴(kuò)增出的一條與紅色性狀相關(guān)的DNA特異帶，我們也將該標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)移到梨圖譜上。本研究得到的2個與紅色性狀相連鎖的標(biāo)記，遺傳距離相對較遠(yuǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。今后的工作應(yīng)該通過加密圖譜的方法得到與該性狀連鎖更為密切的標(biāo)記，從而進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的基因克隆。

3.3 梨果實(shí)性狀的QTL定位及其相互關(guān)系

控制某一性狀的QTL大多聚集在同一連鎖群的相近或相同區(qū)域內(nèi)。本研究定位結(jié)果顯示，控制單果質(zhì)量、橫徑、縱徑、可溶性固形物含量的QTL位點(diǎn)主要集中在某一染色體上，并且相距很近，例如，控制單果質(zhì)量的QTL主要集中在LG7和LGll上，控制橫徑、縱徑QTL主要集中在LG7，而控制可溶性固形物含量的QTL要集中在LGll上。

植物中普遍存在著具有相關(guān)功能的基因成簇分布或者是共分離現(xiàn)象。本研究在LG7上檢測到控制單果質(zhì)量WSF-1和控制縱徑VDF-1兩個QTL位點(diǎn)是共分離的，并且與MES₄₆-115f表現(xiàn)為共分離：在LGll上，控制橫徑的TDF-4和控制可溶性固形物的SSC-4兩個QTL位點(diǎn)表現(xiàn)為共分離。在LG2上，檢測到TDF-1和SSC-1兩個QTL位點(diǎn)相距很近，它們與最近的分子標(biāo)記CH02810-110f的距離分別是1.2cM和1.7cM。在其他植物上也存在著具有相關(guān)性的性狀的QTL位點(diǎn)緊密連鎖的或者聚集的現(xiàn)象。

3.4 主效QTL位點(diǎn)與MAS

MAS是利用目標(biāo)性狀基因與分子標(biāo)記之間緊密連鎖關(guān)系進(jìn)行間接選擇。MAS不受其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，結(jié)果可靠，適用于對目標(biāo)性狀進(jìn)行早期選擇。本研究中利用分子遺傳圖譜檢測到了21個與梨果實(shí)性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)，并且檢測到與這些QTL位點(diǎn)呈共分離或緊密連鎖的分子標(biāo)記，有望通過標(biāo)記輔助選擇對這些重要位點(diǎn)進(jìn)行遺傳操作。如本研究中檢測到一個與控制單果質(zhì)量主效QTL位點(diǎn)WSF-1緊密連鎖的標(biāo)記MES₄₆-115f.2者之間的遺傳距離為0.4cM。

由于不同性狀的QTL位點(diǎn)是緊密連鎖的，QTL位點(diǎn)之間還存在著互作，利用標(biāo)記進(jìn)行選擇時，還要考慮對其他性狀的影響。另外數(shù)量性狀基因與環(huán)境間存在互作，所以要保證定位的QTL準(zhǔn)確性，還要嚴(yán)格地對影響各性狀的環(huán)境因素進(jìn)行控制。因此在定位QTL位點(diǎn)時，還需要分析多年、多點(diǎn)等多種環(huán)境條件作圖群體，擴(kuò)大作圖群體，增加標(biāo)記個數(shù)，精準(zhǔn)定位QTL區(qū)域，為育種工作提供可靠的依據(jù)。

4 結(jié)論

以八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F₁實(shí)生苗為材料，構(gòu)建了包含61個蘋果EST-SSR標(biāo)記、68個蘋果SSR標(biāo)記、49個梨SSR標(biāo)記、1個RAPD標(biāo)記和3個質(zhì)量性狀標(biāo)記，共182個標(biāo)記分屬于19個連鎖群的梨遺傳連鎖圖譜，并對控制果實(shí)可溶性固形物含量、單果質(zhì)量、橫徑、縱徑的QTL位點(diǎn)進(jìn)行了分析和定位。分析表明這4種果實(shí)性狀之間存在著極顯著相關(guān)性，檢測到與性狀連鎖的QTL位點(diǎn)21個，其中主效QTL位點(diǎn)6個(LOD≥13.5)，與果實(shí)性狀相關(guān)的農(nóng)藝性狀QTL位點(diǎn)多集中在LG7和LGll，這些主效QTL位點(diǎn)為分子輔助選擇(MAS)提供了便利。