銀杏中內生細菌的分離鑒定

摘 要：從銀杏(Ginkgo biloba)組織中分離篩選內生細菌，并利用體外篩選與活體篩選相結合的方法進行植物病原拮抗菌的篩選。結果表明，內生細菌A97對甘薯干腐病、梨黑斑病、柑橘綠霉、蘋果青霉等主要園藝產品采后病害具有顯著拮抗作用，能夠在宿主表面有效定殖，并顯著抑制果實表面及傷口處病原菌的侵染，具有良好的應用開發潛力。經過形態特征、生理生化特性以及16S rRNA序列的同源性分析，可確認該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus sub—tilis)

關鍵詞：銀杏；內生細菌；采后病害；生物防治

中圖分類號：S664.3 文獻標識碼：A 文章編號：1009—9980(2010)04—566—04

水果、蔬菜等園藝作物產品因其含有豐富的碳水化合物、有機酸、維生素及無機鹽，而成為人類重要的營養源。但低pH、高水分、高養分以及采收時易受機械創傷等特點，使其極易受真菌病害侵染，而且由此導致的腐爛會產生大量的真菌毒素，嚴重影響產品的最終消費。中國作為世界第一大果蔬生產國，產量約占全球總量的14％，但采后損失為20％～30％，年均經濟損失超過700億元。在有些發展中國家，采后損失甚至超過50％，而其中絕大多數是由于病原菌侵染引起。

目前，針對采后病害的防治，仍然以施用化學殺菌劑為主要防治手段。但隨著全世界對于食品安全和環境污染的日益關注，以及長期使用化學農藥處理導致大量病原菌產生耐藥性等問題的出現，使得開發新型防治技術的呼聲不斷高漲。利用生防菌進行果蔬采后病害的生物防治由于沒有化學防腐保鮮帶來的環境污染、有害物質殘留及連續使用會產生抗藥性等問題，且具有貯藏環境小、貯藏環境易控制、處理目標明確、可避免紫外線和干燥的破壞作用、產品集中、面積小、處理費用低等優點，已經成為目前生防菌研究及應用的熱點。

由于植物內生細菌與植物具有共生關系，對寄生植物具有一定的促生、防病蟲害、固氮等多種生物學作用，是篩選植物病蟲害拮抗菌、固氮菌以及誘導抗病性和轉基因載體的理想來源。銀杏(Ginkgobiloba L.)是世界上最古老的樹種之一，也是現存種子植物中最古老的孑遺植物。作為我國特有的一種植物資源，在觀賞及藥用等方面具有很高的經濟價值。作者從秦嶺山區的野生銀杏中篩選到l株內生細菌，針對該菌株的分離、篩選和鑒定及其對蘋果輪紋病、蘋果干腐病、蘋果青霉等主要采后病害的防治作用進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物用于分離內生菌的銀杏(G.bilo—baL)標本采自秦嶺太白山自然保護區；內生性檢測用銀杏取自西安植物園。

1.1.2 供試果蘋果、番茄等果蔬均購自西安周邊地區果園。

1.1.3 病原菌柑橘綠霉(Penicillium digitatum)、蘋果青霉(Penicillium expansum)、甘薯干腐病(Fusari—um oxysporum)、番茄早疫病(Alternaria solani)、梨黑斑病(Alternaria kikuchiana)等。

以上病原菌均由本實驗室從致病植株中分離、保藏，并參照文獻進行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 內生茵的分離、純化將所采樣品以蒸餾水清洗干凈后進行表面除菌，用經過滅菌處理的枝剪、解剖刀及打孔器將經過表面消毒的葉片、樹皮打孔成約1cm²的小塊，根、莖、枝則切成約0.5～1cm左右的小段(兩端均需有切口)。組織塊表面消毒參考Guo等的三步法，具體如表1所示。

消毒結束后立即用無菌水將組織塊漂洗3～4次，取最后一次清洗液500μL轉入無菌培養皿，倒人PDA培養基，于28℃培養3d，以檢測消毒是否徹底。

將經過表面消毒的組織塊用無菌研缽研磨，并用4層滅菌紗布過濾。滴加200μL濾汁與PDA平板上，涂布均勻后于28℃培養3～15d，根據形態及顏色差異挑取不同菌落，純化后于斜面中保存、備用。

內生性檢測參考文獻的方法，利用利福平標記進行回接測定。

1.2.2 拮抗菌的篩選 采用平板擴散法進行體外篩選。取培養2d的菌株斜面，加無菌水制備成菌懸液后，將其稀釋至10⁸CFU·mL^-1備用。將裝有30mL固體培養基的三角瓶熔化后，置于50℃水浴中。取水浴中的培養基加入1mL病原菌孢子懸液(10⁸spore·mL^-1)，迅速搖勻，倒入滅菌好的干燥培養皿中，待培養基冷卻后于中央位置打孔(直徑D=7mm)，加人5μL待測菌懸液(10⁸CFU·mL^-1)后于30℃下培養3～5d，測定各供試菌株的抑菌圈直徑。

活體(in vivo)篩選。選取外形無損，大小和成熟度接近且無病蟲害的新鮮蘋果，用2％NaCIO溶液表面消毒后，用無菌水清洗多次后自然晾干。在果實表面刺一傷口(3mmx3mm)，分別接種20μL拮抗菌懸液(10⁸CFU·mL^-1)和20mL(10⁸spore·mL^-1)病原菌孢子懸液，對照組中僅加入相同量的致病菌孢子懸液；晾干后將果實裝箱并外附保鮮膜以保持95％左右的相對濕度，室溫下貯藏30d后統計果實的發病率和病斑直徑。每次處理30個果實，重復3次。

1.2.3 拮抗菌的定殖能力測定將20μL拮抗菌懸液(1x10⁸CFU·mL^-1)接種于果實表面傷口(3mmx3mm)，于30℃下保濕培養5d，設接種1h后測定的菌體數為起始值(0h)，每天測1次，測定時用打孔器從傷口處取果肉組織(10mmx10mm)，放于已加入10mL的無菌生理鹽水的研缽中，充分研磨后用稀釋平板法計數。每次測定3個果實，實驗重復3次。

1.2.4 拮抗菌的鑒定形態觀察及理化測試參照《微生物分類學》的方法進行鑒定。

根據原核生物16S rRNA的保守序列合成引物：PrimerA:5’—AGAG2TFGATCATGGCTCAG—3’:Primer H:5’—AAGGAGGTGATCCAGCCGCA—3’。PCR擴增反應條件為：95℃2min；95℃1rain，50℃2min，72℃2.5min，共35次循環；72℃延伸5min。PCR擴增產物以1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢查，并以QIAEXⅡ Gel Extraction System(Qiagen)回收純化后交北京華大基因科技有限公司進行序列測定。采用DDBJ中FASTA程序比對所測DNA序列，并利用Clustalx1.83及MEGEA 4.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5 統計分析實驗數據用SPSS 15.0軟件進行鄧肯氏復極差分析。

2 結果與分析

2.1 內生菌的分離

2.1.1 表面消毒效果的驗證經多次實驗發現，對照組經培養3d后未出現菌落。說明表面消毒徹底，可以排除實驗操作中受環境及植株表面微生物污染的可能。

2.1.2 分離結果根據菌落特征及菌體形態特征的差異，從根、莖及枝葉中共分離得到16株不同類型內生細菌。

2.2 拮抗菌的篩選

2.2.1 體外(in vitro)篩選結果采用平板擴散法對所分離到的菌株進行體外篩選，發現16株內生菌中有9株對于不同病原菌具有一定的抑制作用。其中內生菌A97對于鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢霉屬(Altemaria)、及青霉屬(Penicillium)的多種病原菌均-具有顯著拮抗作用(圖版A-C)。

在PDA平板上菌株A97對于上述3類病原菌具有明顯的抑菌圈。挑取抑菌圈處病原菌的菌絲進行顯微觀察(圖版—D.E)，發現在抑菌圈內病原菌的菌絲產生明顯的扭曲、畸形及局部膨大現象，且無法發育形成健全的產孢結構(如箭頭處所示)。將致畸后的菌絲轉接于PDA培養基上后無法生長。

2.2.2 活體(in vivo)篩選結果在果實上進行活體防病實驗的結果表明，經過菌株A97處理的果實在室溫下貯藏30d后，其3類病原菌在果實上的腐爛率及菌斑平均直徑均明顯小于對照組(圖1)。其中經A97處理后蘋果青霉(P.expansum)的腐爛率降至19.3％，且果實表面的菌斑直徑擴散速度明顯減弱，說明致病菌的生長受到顯著抑制。此外，干腐病(F.oxysporum)及早疫病(A.solani)的致病率也均顯著下降。

由圖版—F～H，F～h可見，對照組果實出現明顯-軟化、萎蔫及色澤暗淡等典型的腐敗老化癥狀，且多數果實傷口處有病斑及大量孢子形成(如圖版H中致病菌孢子已在番茄表面擴散增殖)；而經A97處理后的果實經30d貯存后其外觀正常、色澤鮮亮，傷口處未發生明顯病變。說明在果實傷口處及果肉組織中A97可以有效抑制鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢霉屬(Aternaria)、及青霉屬(PeniciUium)的多種病原菌在采后貯藏期間的侵染及生長，從而減少由此引發的腐敗及病變。

2.3 菌株A97的生理生化鑒定

顯微鏡下觀察，A97菌體為桿狀，具鞭毛，大小約0.8μmX3.0μm；芽孢為柱狀，中生或近中生，孢子囊無明顯膨脹。在營養瓊脂上生長時，菌落為近圓形，邊緣不規則，表面光滑呈乳白色，直徑1～2mm。該菌株的生理生化實驗結果如表2所示。

2.4 菌株A97的分子生物學鑒定

菌株A97的16S rDNAPCR產物長度為1.5kb左右。該序列已在DDBJ注冊，注冊號為AB501113。利用Clustal 1.83對菌株A97的16S rDNA序列和DDBJ中已登錄的16SrDNA序列進行同源性比較，對比結果發現菌株A97與多株枯草芽孢桿菌(B，subtilis)的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99％以上，結合生理生化鑒定結果，可認定菌株A97為芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。利用MEGA4構建的—μJ法系統發育樹如圖2所示。

2.5 菌株A97的內生性檢測

對菌株A97進行利福平標記后，獲得一株穩定的突變體。將其轉接入銀杏后，從植株的莖、枝及葉中均分離到該突變體，說明菌株A97可在銀杏植株體內定殖。

2.6 拮抗菌的定殖能力測定

能夠定殖在果蔬組織的表面并長期存活是生防菌進行采后病害生物防治的必要條件。Cristiansen等研究發現，生防菌與病原菌之間的拮抗作用的強度與2者在宿主表面共生時的生物量相關。因此只有在病原菌侵染果實前搶占生存空間并長期定殖(通過營養競爭或產生足夠量的能夠抑制病原菌生長的次生代謝產物)，才能有效抑制病害的發生。由圖3可見，在接種后的第一天A97生長迅速，而在其后的時間里呈緩速穩步增長趨勢。說明在室溫儲藏條件下，A97能夠在不同果實表面及傷口處實現有效定殖。

3 討論

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)生長迅速，對營養要求單一，抗逆性強，由于可以產生多肽類抗菌素以及對活菌體具有溶菌作用的酶，因而對多種植物病原微生物具有拮抗作用。而且作為自然界中廣泛存在的非致病菌，枯草芽孢桿菌對人畜無害且不會造成環境污染，因而是目前國內外選育生防菌的主要來源之一。植物內生性芽孢桿菌由于與宿主存在的共生關系，能夠在植物組織和葉際的微生態環境中迅速定殖生長，而其所產生的芽孢對于紫外線輻射、低溫、干燥等環境具有良好的耐受性。這些特性都是理想的采后病害生防菌的必要條件，因而具有良好的開發潛力。

研究從秦嶺野生銀杏植株的組織中分離得到一株內生細菌，編號為A97，經鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。通過利用體外(in vitro)和活體(in vitro)相結合的篩選方法發現A97對于多種采后病害的病原菌如鐮刀菌屬(Fusariztm)、鏈格孢霉屬(Alternaria)、及青霉屬(Penicileum)均具有顯著拮抗作用。同時，在果實上的生長動態測定也表明該菌株能夠在多種果蔬的表面及傷口處有效定殖并抑制病害發生，具有較好的應用開發潛力。下一步將針對其抑菌機理以及該菌株與所附生的植物表面環境間的關系進行研究，為開發新型采后病害生防制劑打下基礎。