益生菌中膽鹽水解酶作用機理研究現狀

任婧，吳正鈞，王蔭榆

（光明乳業股份有限公司技術中心基礎研究部，上海 200436）

益生菌中膽鹽水解酶作用機理研究現狀

任婧，吳正鈞，王蔭榆

（光明乳業股份有限公司技術中心基礎研究部，上海 200436）

對乳酸菌中膽鹽水解酶研究現狀進行分析，從編碼基因、蛋白氨基酸結構以及酶與腸道間密切關系等方面入手，闡述了腸道益生菌通過膽鹽水解酶對膽鹽的水解，可以達到耐受腸道膽鹽壓力，增強細菌表面對體內免疫系統的抵抗能力建立長期感染，促進在高等動物腸道內細菌的定殖，降低血清膽固醇水平等作用，為最終治愈高膽固醇血癥提供了良好的解決方案。

膽鹽；膽鹽水解酶；bsh益生菌；高膽固醇血癥

0 引 言

益生菌是指那些對人、動物產生有益影響的活性微生物，通過攝入一定的數量后，對宿主可產生一種或多種特殊的、超越其固有基本營養價值的保健作用。動物對益生菌具有選擇性，通常體現在很多物理壓力方面，如低pH值、耐膽汁、以及滲透壓和功能性選擇等；而可以耐受膽鹽是益生菌被選擇的重要特征。本文綜述了益生菌中膽鹽水解酶作用機理研究現狀。

1 膽酸循環及膽鹽水解過程

在哺乳動物中膽固醇（cholesterol）代謝終產物就是在肝臟中從頭合成膽汁酸。膽汁酸通過與牛磺酸（taurine）或甘氨酸（glycine）交聯形成膽鹽（bile salt），然后隨膽汁一起分泌。膽汁是一種黃綠色溶液，主要成分除膽汁酸外還包括膽固醇、磷脂以及膽綠素等。它的功能主要是作為生物溶劑乳化和溶解脂肪，因此在脂肪代謝中具有重要意義。另外它也具有潛在的抗菌活性，因為可以溶解微生物膜。初級膽汁酸，包括膽酸（cholic acid）及牛黃鵝去氧膽酸（chenodeoxycholicacid）在肝臟中從膽固醇從頭合成。疏水的甾醇核通過與甘氨酸或牛磺酸交聯可溶性增加，因此形成兩性的可以溶解脂肪的混合微膠粒。隨著食物中脂肪的攝入，它們與脂肪混合、乳化，為下一步在十二指腸吸收做好準備。膽汁酸通過腸肝再循環在體內保持穩定的水平。在整個腸道內游離和結合膽汁酸通過被動擴散的方式被吸收，在回腸末端則以主動轉運形式吸收。被重吸收的膽汁酸進入血液循環系統被肝實細胞攝入重交聯，再次釋放進入膽汁[1]，如圖1。

近日來很多研究開始嘗試，利用哺乳動物腸道微生物群與膽鹽交聯，來降低高膽固醇血癥患者血清中的膽固醇，以及預防正常膽固醇水平人群中高膽固醇血癥的發生。腸道微生物對膽固醇調控很重要一部分是通過膽鹽水解酶（Bile Salt Hydrolase,BSH）對交聯膽鹽水解，從而降低血清膽固醇含量來達到的。BSH催化牛磺酸或甘氨酸與甾醇基礎的膽汁酸之間的氨基骨架水解。去交聯的膽酸具有較低的水溶性，很容易被分泌到糞便中。由于糞便膽酸流失以及膽鹽的降低使得肝臟增加膽固醇轉化為膽鹽來維持膽鹽代謝平衡。已有實驗證明，口服含膽鹽水解酶的乳酸菌可以在動物及人體內降低血清中膽固醇水平。

對于水解膽鹽活力最常用的檢測方式即在瓊脂平板上觀察菌落周圍水解圈的出現。由于乳酸菌發酵在腸道內有時會形成局部pH較低的微環境，未交聯的膽酸相比交聯狀態的膽酸會對細菌產生抑制作用，從而產生沉淀。這是我們在瓊脂平板檢測BSH活性的基礎，如圖2[2]。

2 膽鹽水解酶bsh編碼基因背景研究

BSH活性已經在乳酸菌Lactobacillus、雙歧桿菌Bifidobacterium、腸球菌Enterococcus梭菌Clostridium以及 類菌體Bacteroides等細菌中被發現[3-7]。其中乳酸菌及雙歧桿菌被常規認作益生菌，而類菌體梭菌以及腸球菌則是腸道共生菌。目前為止，尚未在生活環境缺乏膽鹽的細菌中發現具有BSH活性的菌株。除了兩株類菌體以外，其他BSH活性陽性細菌均為革蘭氏陽性菌。在其他所有腸道革蘭氏陰性菌中，包括大腸桿菌Escherichia coli以及腸道沙門氏菌Salmonella enterica等均未發現BSH活性，也沒有找到bsh同源基因。在公共數據庫中包括美國國立衛生院基因組數據庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/以及美國Joint基因組研究所微生物基因組網站http：//genome.jgi-psf.org/，我們可以檢索到在已發現的益生菌中存在的編碼BSH酶的基因組序列，如圖3[8]。包括產氣莢膜桿菌C.perfringens，植物乳桿菌La.plantarum，約氏乳桿菌La.johnsonii，長雙歧桿菌Bi.Longum，兩歧雙歧桿菌Bi.Bifidum，青春雙歧桿菌Bi.Adolescentis，以及單增李斯特氏菌Listeria monocytogenes等等.通過微生物基因組學的分析很多bsh同源基因以及預測基因也已被發現。有趣的是，在有些菌株如植物乳桿菌WCFS1中我們發現不止一個同源基因的存在[9]。同時存在多個bsh同源基因對于研究bsh基因功能具有重要意義。

在植物乳桿菌中預測存在4個相關基因，分別命名為bsh1到bsh4。他們分散在整個基因組上，之間的氨基酸同源度從21%到39%。Lambert及Bongers等人對植物乳桿菌WCFS1中的4個bsh基因進行了深入研究，在bsh缺乏的乳酸乳球菌中分別過表達這4個bsh基因，并且構建了1個、2個、3個以及全部bsh基因敲除模型，對每個基因水解底物能力及對底物耐受性進行了相關評價。并且對若干株植物乳桿菌進行全基因組雜交（complete genome hybridization,CGH）實驗結果表明，bsh2、bsh3及bsh4在植物乳桿菌各菌株間十分保守，具有重要的生理學意義，而bsh1基因則和植物乳桿菌BSH活性密切相關，如圖4[9]。

3 BSH膽鹽水解酶氨基酸結構及底物識別分析

在各個種屬之間bsh編碼區的調節和組織都有所差異。BSH酶的亞基組成、大小、最適pH值、動力學性質、底物特異性等等也變化較大。然而這些BSH卻擁有一些保守的活性氨基酸位點：cysteine 2（Cys2）,arginine 18（Arg18）,aspartic acid 21（Asp21）,asparagines 175（Asn175）,and arginine 228（Arg228）（圖5）。

膽鹽水解酶屬于膽酰甘氨酸水解酶家族（choloylglycine hydrolase family）。 青 霉 素 酰 胺 酶（penicillin amidases）也屬于該家族成員，該酶可水解青霉素（penicillin）變為6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillinic acid），這一產物被廣泛應用于半合成抗生素的工業生產中。膽鹽水解酶和青霉素酰胺酶都被歸類為親核水解酶（N-terminal nucleophilic（Ntn）hydrolases），在N端帶有半胱氨酸（cysteine 2，Cys2）殘基。在蛋白自身酶解過程中初始的甲硫氨酸Met被去除后Cys2便成為催化中心，這也是Ntn水解酶超家族的共同點。近日產氣莢膜梭菌Clostridium perfringens中的BSH酶被結晶出來，同時發現以脫輔酶（apoenzyme）及與牛磺脫氧 膽 酸 鹽 （taurodeoxycholate）（TDCA;hydrolyzed product）結合成復合物形式存在。結構分析表明Cys2殘基處于被親核攻擊的位置。已有實驗表明Cys2的巰基（SH）基團對膽鹽水解酶催化能力十分重要，在兩歧雙歧桿菌中將BSH帶有硫醇基的Cys2置換為帶羥基的親核氨基酸Ser或Thr，則BSH失去活性[10]。在長雙歧桿菌中若把BSH的Cys2置換為Ala，同樣得到的是失活蛋白[11]。

圖4中，橫坐標從左到右依次代表：WCFS1為 野 生 型 ；NZ5330為 Δbsh2，Δbsh3，Δbsh4；NZ5328為Δbsh1，Δbsh3，Δbsh4；NZ5326為Δbsh1，Δbsh2，Δbsh4；NZ5324為Δbsh1，Δbsh2，Δbsh3；NZ5332為Δbsh1，Δbsh2，Δbsh3，Δbsh4。

同時和球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）的青霉素V酰化酶（penicillin V amidase）具有高度同源性。青霉素V酰化酶的tyrosine 82（Tyr82）與BSH酶氨基酸Asn82的差異由于不同底物空間需要的差異引起。

BSH對底物膽酸的識別很可能既通過對膽酸甾類化合物的識別，也通過氨基酸集團的識別。Moser和Savage等人曾經報道在布氏乳桿菌L.buchneri JCM1069可以表達牛磺酸脫氧膽酸水解酶活性，但是卻不具有牛磺酸膽酸水解酶活性[12]。牛磺酸脫氧膽酸與牛磺酸膽酸都具有牛磺酸的氨基酸部分，然而他們的甾醇部分卻不同。另外在嗜酸乳桿菌NCFM中，當使bshA基因失活，該菌株水解含鵝脫氧膽酸甾醇部分 （如TCDCA和GCDCA）的膽鹽活力降低[13]。不過在大多數動力學研究報告中，底物識別仍然是以氨基酸部分優先識別。大多數BSH酶水解甘氨酸交聯的膽鹽能力要強于牛磺酸交聯的膽鹽。序列分析表明雖然BSH活性位點的氨基酸十分保守，然而底物識別的位點卻不是十分保守。

4 BSH與腸道的關系

膽鹽水解與耐膽鹽能力：因為具有去交聯膽鹽的能力，膽鹽水解酶被認為可能具有解除膽鹽毒性的作用。有4個獨立研究小組利用野生型和bsh突變型細菌對膽鹽水解與膽鹽耐受力之間的關系進行了研究。在用亞硝基胍對食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus）進行突變篩選中，得到一株BSH活力顯著下降的突變株，在膽鹽存在的情況下生長速度明顯減緩[14]。在植物乳桿菌和單增李斯特菌中bsh基因產生突變，其對膽汁和膽鹽十分敏感，耐受力明顯下降[15]。然而BSH酶在膽汁耐受過程中的作用機理目前仍不明確。有假說提出，質子化未解離的膽鹽可以如同有機酸一般通過細胞內酸化產生毒性，而具BSH活力細胞可以形成弱結合對抗物保護自己，對捕獲以及轉運質子造成的PH下降具有緩沖作用。

在人體內甘氨酸結合膽鹽與牛磺酸結合膽鹽比例為3∶1。體外實驗表明，牛磺酸交聯膽鹽通常在任何pH情況下對細菌都僅有輕微影響，而甘氨酸交聯的膽鹽在酸性條件下以及bsh突變時則具有非常強的毒性。因此我們認為BSH在低pH條件下對解除甘氨酸交聯膽鹽毒性十分重要。當膽汁進入十二指腸時胃部會產生反酸，或者在腸道局部會產生pH較低的微環境，這時BSH意義重大。有文獻報道BSHs通常會優先水解甘氨酸結合的膽鹽,也有研究小組證實BSHs會傾向于微酸的環境（5到6之間）。這些報道是對這一結論有力的支持。

細菌膜特性改變：溶菌酶溶酶體（bacteriolytic enzymes lysozyme）、磷脂酶以及抗菌肽等都是高等生物腸道內體內免疫的重要執行者。細菌膜結構的組成、滲透性、流動性、凈電荷以及疏水性都與細菌對寄主防御能力息息相關。有研究提出BSH可以促進膽固醇或膽汁參與細菌膜結構構成，使膜抗張強度增加，改變膜流動性及電荷等。BSH對細胞表面的改變可以增強細菌表面對體內免疫系統的抵抗能力，這種抵抗機制對建立長期感染具有重要作用。在商業中對于篩選強力BSH酶對抗BSH陰性病原菌效果顯著。

促進高等動物腸道內細菌的定植：在BSH作用下膽鹽去交聯所產生的氨基酸，可以當作碳源、氮源以及能量來源被廣泛利用。甘氨酸的代謝產物為氨和二氧化碳，而牛磺酸則可被代謝為氨、二氧化碳及硫酸鹽。因此具有水解能力的菌株可能在生長時獲得營養優勢。Huijghebaert等人和Van Eldere等人[16]曾經觀察到一株BSH陽性梭菌利用水解釋放的牛磺酸作為電子受體，因此在牛磺酸和牛磺酸交聯膽鹽存在的情況下生長速度明顯加快。在長雙歧桿菌中也觀察到，bsh基因總是同時伴隨編碼谷氨酰胺合成腺苷轉移酶glnE同源基因共轉錄，該基因同時也是氮元素調節級聯反應的一部分。

降低血清膽固醇：高膽固醇血癥近年來被認為是冠狀動脈心臟病的罪魁禍首。雖然已有不少治療藥物如他汀類藥物（tatins）及膽酸結合劑等，但存在價格昂貴、副作用大等問題。口服益生菌目前被廣泛報道具有明顯降低膽固醇的能力，病例中約有22%到33%的患者膽固醇含量明顯下降[17]。而小鼠實驗也表明在肥胖小鼠飲食中添加益生菌可阻止膽固醇水平繼續提高。益生菌降低膽固醇水平有多種途徑，包括細菌對膽固醇同化作用，細菌胞壁結合膽固醇，以及短鏈脂肪酸發酵終產物作用等等，但BSH降低膽固醇是非常重要的途徑。去交聯的膽酸比交聯狀態膽酸更不易吸收，因此大量自由膽酸通過糞便排泄出體外。同樣自由膽酸也使腸道對脂肪的溶解及吸收效率降低。因此去交聯膽酸可以導致血清膽固醇含量降低，一方面為補償通過糞便排泄損失的自由膽酸而要求膽固醇從頭合成膽酸，另一方面降低膽固醇溶解度減少了腸道對其的吸收。

5 展 望

綜上所述，膽鹽水解對于脊椎動物脂肪代謝起著重要作用。在食物脂肪被攝入后，隨著帶有膽鹽水解酶活力的腸道益生菌作用下，血清膽固醇被降低，腸道菌定殖能力提高，從而更好地維持腸道生態平衡。不過在眾多的研究中仍存在一些不同看法。有研究者提出，由于去交聯膽酸相對乳化食物脂肪和形成微粒能力降低會使得一部分正常脂肪吸收被影響。研究表明在雞中BSH活性和雞的發育不良有關[18]，但在小鼠中未見報道。另外也有稱去交聯膽酸產生的二級膽酸可能對腸道功能造成一定紊亂。有一些實驗也報道在膽鹽耐受力與BSH活性之間未找到直接證據，但他們有的使用了牛磺酸結合膽酸而非BSH傾向結合的甘氨酸膽酸來檢測BSH活性，有的則采用非等位基因菌株來研究，這對于腸道內復雜的影響因素來說不是合適的研究對象。因此這些研究并不能說明BSH真正的活性與耐膽鹽能力關系。隨著對BSH酶研究的越來越多，我們對于其作用機制和原理也會了解更多，這使我們闡明腸道微生物選擇生存機理成為可能，同時也為發展更強健的益生菌提供了很好的研究基礎。

[1]JASON M R,DAE-JOONG K,PHILLIP B H.Bile Salt Biotransformations by Human Intestinal Bacteria[J].Journal of Lipid Research，2006，47：241-259.

[2]OH H K JI Y L,SOO J L,et al.Molecular Cloning and Characterization of a Bile Salt Hydrolase from Lactobacillus acidophilus PF01[J].J Microbiol Biotechnol,2008，18（3）：449–456.

[3]BATEUP J M,MCCONNELL M A,JENKINSON H F,et al.Comparison of Lactobacillus Strains with Respect to Bile Salt Hydrolase Activity,Colonization of the Gastrointestinal Tract,and Growth Rate of The Murine Host[J].Appl Environ Microbiol，1995,61：1147–1149.

[4]GRILL J P,MAGINOT-DURR C,SCHNEIDER F,et al.Bifidobacteria and Probiotic Effects：Action of Bifidobacterium Species on Conjugated Bile Salts[J].Curr Microbiol，1995,31：23–27.

[5]FRANZ C M A P,SPECHT I.Bile Salt Hydrolase Activity of Enterococci Isolated from Food：Screeningand Quantitative Determination[J].J Food Prot，2001,64：725–729.

[6]COLEMAN J P,HUDSON O L L.Cloning and Characterization of a Conjugated Bile Acid Hydrolase Gene from Clostridium Perfringens[J].Appl Environ Microbiol，1995,61：2514–2520.

[7]STELLWAG E J,HYLEMON P B.Purification and Characterization of Bile Salt Hydrolase from Bacteroides Fragilis Subsp[J].Fragilis Biochim Biophys Acta，1976,452：165–176.

[8]MáIRE BEGLEY,COLIN H,CORMAC G M G.Bile Salt Hydrolase Activity in Probiotics[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,1729–1738.

[9]JOLANDA M L,ROGER S B,WILLEM M D V,et al.Functional Analysis of Four Bile Salt Hydrolase and Penicillin Acylase Family Members in Lactobacillus plantarum WCFS1[J].Applied and Environmental Microbiology,2008,p.4719–4726

[10]BOGGS J M.Lipid Intermolecular Hydrogen Bonding：Influence on Structural Organization and Membrane Function[J].Biochim Biophys Acta，1987,906：353–404.

[11]TANAKA H,HASHIBA H,KOK J,et al.Bile Salt Hydrolase of Bifidobacterium Longum：Biochemical and Genetic Characterization[J].Appl Environ Microbiol，2000,66：2502–2512.

[12]MOSER S A,SAVAGE D C.Bile Salt Hydrolase Activity and Resistance to Toxicity of Conjugated Bile Salts are Unrelated Properties in Lactobacilli[J].Appl Environ Microbiol，2001,67：3476–3480.

[13]MC AULIFFE O,CANO R J,KLAENHAMMER T R.Genetic Analysis of Two Bile Salt Hydrolase Activities in Lactobacillus Acidophilus NCFM[J].Appl Environ Microbiol，2005,71：4925–4929.

[14]GRILL J P,CAYUELA C,ANTOINE J M,et al.Isolation And Characterization of A Lactobacillus Amylovorus Mutant Depleted in Conjugated Bile Salt Hydrolase Activity：Relation Between Activity and Bile Salt Resistance[J].J Appl Microbiol，2000,89：553–563.

[15]DUSSURGET O,CABANES D,DEHOUX P,et al.Listeria Monocytogenes Bile Salt Hydrolase is a Prfa-Regulated Virulence Factor Involved in The Intestinal and Hepatic Phases of Listeriosis[J].Mol Microbiol，2002,45：1095–1106

[16]HUIJGHEBAERT S M,MERTENS J A,EYSSEN H J.Isolation of a Bile Salt Sulfatase-Producing Clostridium Strain from Rat Intestinal Microflora[J].Appl Environ Microbiol，1982,43：185–192.

[17]PEREIRA D I,GIBSON G R.Effects of Consumption of Probiotics and Prebiotics on Serum Lipid Levels in Humans[J].Crit Rev Biochem Mol Biol[J].2002,37：259–281.

[18]FEIGHNER S D,DASHKEVICZ M P.Effect of Dietary Carbohydrates on Bacterial Cholyltaurine Hydrolase in Poultry Intestinal Homogenates[J].Appl.Environ.Microbiol,1988,54：337–342.

Research progress on mechanism of bile salt hydrolase in probiotics

REN Jing,WU Zheng-jun,WANG Yin-yu
（Basic Research Department,Technical Center of Bright Dairy&Food Co.Ltd.,Shanghai 200436,China）

Bile salt hydrolysis plays an important role in digestion of lipids and fat metabolism in vertebrates.We analyse the research progress of bile salt hydrolase base on the works of coding sequences,structure of amino acids and relationship between bile salt hydrolase and intestine.It is shown that the intestinal microbiota can resistant the bile salt stress and increase the ability of resistance of innate immune system.This give a great hint that we can imagine the day hypercholesterolemia be cured and serum lipids are reduced by intestinal microbiota colonization.

bile salt；bile salt hydrolase；bsh probiotics；hypercholesterolemia

Q556

B

1001-2230（2010）02-0045-04

2009-09-11

任婧（1980-），女，博士，研究方向為微生物分子生物學及遺傳學。