阿魏酸存在下酪蛋白的酶促交聯與一些性質變化

李君文,趙新淮

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

阿魏酸存在下酪蛋白的酶促交聯與一些性質變化

李君文,趙新淮

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

在pH值為9.5，阿魏酸存在和37℃的條件下，利用辣根過氧化物酶（EC 1.11.1.7）和過氧化氫對酪蛋白進行氧化交聯，并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和紫外吸收分析確認交聯作用。在蛋白質質量分數為0.04%時，交聯酪蛋白的乳化活性指數、乳化穩定性分別比酪蛋白提高25.2%和7.0%。利用葡萄糖酸–δ–內酯制備酪蛋白和交聯酪蛋白的酸化凝膠，掃描電子顯微鏡觀察可以看出交聯酪蛋白凝膠的微觀結構中空穴減少，形成了更為致密的結構。

酪蛋白；辣根過氧化物酶；阿魏酸；交聯；乳化性質

0 引 言

酪蛋白是牛乳中質量分數最多的蛋白質，占總量的80%～82%[1]。酪蛋白的改性處理，例如交聯，可以改變它的功能性質。蛋白質交聯是在蛋白質內部或蛋白質之間形成共價鍵[2]，交聯的方法有化學法、物理法和酶法。酶法交聯多采用轉谷氨酰胺酶[3-4]，極少采用過氧化物酶，只有1篇報告涉及酪蛋白的氧化交聯[5]。研究表明，酪蛋白經辣根過氧化物酶氧化交聯后改善了乳化性。

在氧化酶存在下，阿魏酸等能與賴氨酸等殘基反應并導致交聯。為此，本研究以阿魏酸為交聯劑，在H2O2存在下利用辣根過氧化物酶對酪蛋白進行氧化交聯，通過樣品的凝膠電泳和光譜分析，確認交聯反應，并對交聯酪蛋白的乳化性質、酸化凝膠的微觀結構進行分析，評價氧化交聯對這些性質的影響。

1 實 驗

1.1 材料

酪蛋白；辣根過氧化物酶；阿魏酸；精煉大豆油；研究用水為去離子水，其他化學試劑均為分析純試劑。

1.2 主要設備

DELTA 320型pH計，2300型全自動凱氏定氮儀，DHP-9082型電熱恒溫培養箱，WD-9405型水平搖床，P/ACE MDQ 毛細管電泳系統，UV-2401PC紫外可見分光光度計，LGJ-1型冷凍干燥機，高速組織勻漿機，凝膠成像分析系統，S-5700掃描電子顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 交聯反應確認

采用單因素試驗，固定酪蛋白質量分數為5%，pH值為9.5（濃度0.2 mol/L碳酸鹽緩沖體系）、溫度37℃、辣根過氧化物酶添加量為420 U/g酪蛋白、質量分數為3%的過氧化氫溶液加1 mL，阿魏酸濃度為8 mmol/L，于37℃恒溫培養箱內水平搖床振蕩，進行酪蛋白進行交聯反應，反應時間分別為0.5～3 h。反應完成后于85℃水浴鍋加熱滅酶10 min，冷卻后–20℃保存。

（1）SDS-PAGE分析。采用穩壓法電泳。每孔進樣10 μL，濃縮膠質量分數為3%，分離膠質量分數為12%。樣品處于濃縮膠時電壓為80 V，待溴酚藍前沿進入分離膠后加壓至120 V，待溴酚藍距離下緣0.5～1.0 cm時停止電泳，剝離凝膠，固定、染色和脫色，直至蛋白質條帶清晰、背景色完全褪去，凝膠成像。

1.3.1.2 光譜分析

將所有的樣品液稀釋成蛋白質質量濃度為1 g/L，分別于波長280 nm和315 nm處測定吸光度值，計算A315/A280[6]。

1.3.2 交聯酪蛋白制備

用pH值為9.5碳酸鹽緩沖溶液配制質量分數為5%的酪蛋白溶液，采用優化后的交聯反應條件（本文不詳細介紹），加入3 μkat·g-1蛋白的辣根過氧化物酶、質量分數為3%過氧化氫1mL以及阿魏酸濃度為6mmol/L，37℃恒溫培養箱用水平搖床振蕩反應0.7 h，85℃滅酶10 min，冷卻后–20℃保存。

1.3.3 乳化活性指數及乳化穩定性測定

配制質量分數為0.01%，0.02%，0.03%和0.04%的交聯酪蛋白溶液。取75 mL溶液與25 mL大豆油混合，以12 000 r/min均質1 min，靜置，在0 min和10 min時從容器底部取50 μL乳狀液于試管中，加5 mL質量分數為0.1%的SDS，500 nm處測定吸光度（以0.1%SDS調節零點）。同樣處理、測定酪蛋白。乳化活性指數（EAI）及乳化穩定性（ESI）的計算為[8]

式中：A0為零時刻的吸光度；C為酪蛋白質量濃度（g/mL）；Φ為油相體積分數；A10為靜置10 min后的吸光度。

1.3.4 酸化凝膠微觀結構觀察

取一定量的酪蛋白樣品，攪拌溶解，并用濃度為0.2 mol/L鹽酸調節pH值 7.0左右。利用超聲波處理10 min，定容，配制質量分數為3%的酪蛋白溶液。酪蛋白溶液加一定量的葡聚糖–δ–內酯，40℃水浴鍋中恒溫放置至pH值約為4.0，取出后4℃冰箱保存，制得凝膠樣品。將凝膠從冰箱中取出，室溫放置，取樣。樣品于4℃溫度條件下固定于質量分數為2.5%的戊二醛溶液中1 h以上，分別用質量分數為50%、70%和90%乙醇進行梯度洗脫，每次洗脫10 min，然后用體積分數為100%乙醇洗脫兩次，每次15 min；分別用1∶1的100%乙醇和叔丁醇、叔丁醇分別置換15 min；將樣品置于冷凍干燥機中冷凍12 h，冷凍樣品取出，用雙面膠將樣品固定于掃面電子顯微鏡的樣品臺上，然后在離子濺射儀中鍍金；最后，用掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀結構，加速電壓為5 kV，放大倍數為5 000倍。

2 結果與討論

在過氧化氫、酚類化合物存在下，過氧化物酶催化的蛋白質氧化交聯反應的機理為[8]：酚酸或者其它的多元酚經過氧化物酶的作用氧化成醌，醌與蛋白質中一些氨基酸殘基的基團（氨基或巰基）發生反應生成加成物，并再次形成酚羥基結構。后者可以再次被氧化并結合第二個蛋白質肽鏈，從而形成交聯化合物（即交聯蛋白）。所以，交聯蛋白具有不同于原來蛋白質的分子質量，并且由于分子體積增加，導致其功能性質發生變化。阿魏酸為植物性食品中的一個常見酚酸，可以作為交聯劑用于蛋白質的交聯處理，以開發新型蛋白質配料。

2.1 辣根過氧化物酶催化酪蛋白氧化交聯

2.1.1 SDS-PAGE電泳驗證

對不同反應時間的交聯酪蛋白樣品進行SDS–PAGE分析，結果如圖1所示。由圖1可以看出，交聯酪蛋白泳道 （泳道1～5）在97.4 ku以上有明顯的條帶存在，而酪蛋白泳道（泳道0）則沒有；同時，交聯酪蛋白泳道中31 ku以下沒有蛋白質條帶，而酪蛋白泳道則有。電泳譜圖的結果顯示，在阿魏酸和過氧化氫的存在下，辣根過氧化物酶催化酪蛋白發生交聯，形成更大分子的蛋白質。

圖1中，泳道M為標準蛋白；泳道0為酪蛋白樣品；泳道1～5為反應時間分別為0.5，1，1.5，2，3 h的交聯酪蛋白樣品

2.1.2 光譜分析

對不同反應時間的交聯酪蛋白樣品的紫外吸收分析結果如圖2所示。與未反應的酪蛋白相比（反應時間為0 h），交聯酪蛋白樣品的A315/280比值降低，但0.5 h后基本不變。由于酪蛋白在280 nm處有最大吸收，并且反應過程中其質量分數不變，而阿魏酸在315 nm處有最大吸收，所以A315/280比值可以反映出交聯反應過程中酪蛋白、阿魏酸之間的相對變化關系。可以看出，反應0.5h后A315/280比值從0.6減小至接近0.4，說明阿魏酸含量的相對的減少了。這一結果間接地表明，在過氧化氫存在下辣根過氧化物酶促酪蛋白發生交聯反應，阿魏酸參與了酪蛋白的交聯反應，且交聯反應在進行了0.5 h后，反應程度變化不大。

2.2 交聯酪蛋白的乳化活性和乳化穩定性

對酪蛋白、交聯酪蛋白的乳化活性和乳化穩定性進行相關評價結果如圖3所示。與酪蛋白相比，在蛋白質質量分數低于0.03%時，交聯酪蛋白的乳化活性指數較低；在蛋白質質量分數為高于0.03%時，交聯酪蛋白的乳化活性指數高于酪蛋白；在蛋白質質量分數為0.04%時，交聯酪蛋白的乳化活性指數增加25.2%。同樣，交聯酪蛋白的乳化穩定性整體上略好于酪蛋白；當蛋白質質量分數為0.04%時，其乳化穩定性增加7.0%。這可能是由于交聯形成共價聚合物，交聯蛋白質分子的黏彈性比單體酪蛋白分子要高，界面蛋白膜的穩定性提高，油滴不易聚集，從而使乳化穩定性得到改善。整體上看，交聯反應整體上改善了酪蛋白的乳化性質，尤其是在乳化活性指數上改進較大。這是均是由于酪蛋白交聯以后，增加了其分子的體積,因此有利于其乳化性質的改善。

2.3 交聯酪蛋白的酸化凝膠微觀結構

圖4為利用葡萄糖酸–δ–內酯制備的酪蛋白、交聯酪蛋白的微觀結構分析結果。由圖4（a）可以看出，酪蛋白微觀結構松散、存在較大的空穴；而圖4（b）中的交聯酪蛋白微觀結構，呈現出更致密的網狀結構。這是由于阿魏酸、過氧化物酶的存在，可以將酪蛋白分子以“手拉手”的形式連接起來，形成了共價聚合物，更有利于蛋白質分子形成有序、致密的空間結構。因此，酪蛋白在阿魏酸存在下的過氧化物酶催化氧化交聯，可以有效的改善其酸化凝膠的微觀結構，并將最終影響其質地。

3 結 論

（1）在過氧化氫和阿魏酸存在的條件下，利用辣根過氧化物酶的催化作用可以實現酪蛋白的氧化交聯，該交聯可以通過SDS–PAGE、光譜分析和毛細管電泳三方面得到確認。

（2）與酪蛋白相比，在蛋白質質量分數為0.04%時，交聯酪蛋白的乳化活性指數、乳化穩定性分別提高25.2%和7.0%。

(3)利用葡萄糖酸–δ–內酯制備酪蛋白、交聯酪蛋白凝膠，通過掃描電子顯微鏡觀察、比較，交聯酪蛋白所形成的酸化凝膠，其微觀結構中空穴減少，具有更致密的結構。

[1]張建忠.酪蛋白和酪蛋白制品的開發[J].中國乳品工業.1998,26(6):31-32.

[2]FEENEY R E,WHITAKER J R.Importance of Cross-linking Reactions in Proteins[J].Advances in Cereal Science and Technology,1987,9:21-46.

[3]BONISCH M P,HUSS M,WEITL K,et al.Transglutaminase Crosslinking of Milk Proteins and Impact on Yoghurt Gel Properties[J].International Dairy Journal，2007,17(11):1360-1371.

[4]TRESPALACIOS P,PLA R.Simultaneous Application of Transglutaminase and High Pressure to Improve Functional Properties of Chicken Meat Gels[J].Food Chemistry,2007,100(1):264-272.

[5]STEFFENSEN C L,MATTINEN M L,ANDERSEN H J et al.Cross-linking of Tyrosine-Containing Peptides by Hydrogen Peroxide-Activated Coprinus Cinereus Peroxidase[J].European Food Research and Technology,2008,227(1):57-67.

[6]TENOVUO J,PAUNIO K.Peroxidase-Catalysed Formation of Dityrosine,a Protein Cross-Link in Human Periodontal Ligament Collagen[J].Archives of Oral Biology,1979,24(8):591-594.

[7]KINGSLEY K,ADDOB A K,XIONG Y L.Emulsifying and Foaming Properties of Transglutaminase-Treated Wheat Gluten Hydrolysate as Influenced by pH,Temperature and Salt[J].Food Hydrocolloids,2009,23(1):72-81.

[8]STRAUSS G,GIBSON S M.Plant Phenolics as Cross-Linkers of Gelatin Gels and Gelatin-Based Coacervates for Use as Food Ingredients[J].Food Hydrocolloids，2004,18(1):81-89.

Oxidative cross-linking of casein by peroxidase in the presence of ferulic acid and impacts on some selected properties

LI Jun-wen,ZHAO Xin-huai
(Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Horseradish peroxidase(EC 1.11.1.7)and peroxide hydrogen was used to oxidative cross-link casein in presence of H2O2 and ferulic acid at 37℃and pH=9.5.Cross-linking of casein occurred was first demonstrated by SDS-PAGE and spectroscopic analysis.Crosslinked casein was then prepared and used to analyze its emulsifying activity index,emulsifying stability index and microstructure of acidified gel.The emulsifying activity index and emulsifying stability index of cross-linked casein at concentration of proteins of 0.04%(w/w)were enhanced about 25.2%and 7%compared to that of casein at same concentration of proteins,respectively.The gel microstructure of cross-linked casein prepared by acidification of glucono-δ-lactone was observed by scanning electron microscopy as more compact and uniform structure.

casein;horseradish peroxidase;ferulic acid;cross-linking;emulsifying property

TS252.1

A

1001-2230（2010）03-0007-03

2009-11-11

國家高技術發展計劃（863）（2006AA10Z324）。

李君文（1963-）女，碩士研究生，從事食品蛋白質研究。

趙新淮