戊糖乳桿菌WH12-2-1產細菌素條件的優化

蘇芳，李莉，羅斌，孟和畢力格

（內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,呼和浩特010018）

戊糖乳桿菌WH12-2-1產細菌素條件的優化

蘇芳，李莉，羅斌，孟和畢力格

（內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,呼和浩特010018）

以分離自內蒙古傳統乳制品中的戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)WH12-2-1為試驗菌株，研究其產細菌素的最佳條件，以提高該菌產細菌素的能力。對碳源、氮源等培養基成分及培養條件進行優化，并采用響應平面法確定其最佳的碳源、氮源和緩沖鹽的質量濃度。結果表明，L.pentosusWH12-2-1在37℃（pH值為7.0），抑菌活性最佳，培養基成分為：大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖30 g/L，檸檬酸鈉6 g/L，磷酸氫二鉀6 g/L，乙酸鈉15 g/L，Tween-80 2 g/L，硫酸鎂1 g/L，硫酸錳50 mg/L，硫酸亞鐵50 mg/L。此條件下，細菌素的產量是原來的3.38倍。

糖乳桿菌WH12-2-1；細菌素；優化

0 引 言

細菌素（Bacteriocin）是細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌活性的肽或前體[1]，通常認為它只作用于與產生菌同種的其他菌株或與其親緣關系很近的種[2]。細菌素無致畸變作用，無毒性蓄積作用，也不易產生耐藥性，近年的研究又揭示了細菌素不僅有直接抑菌的活性，而且對宿主有免疫抑制、免疫激活和免疫增強等調節功能[3]，所以細菌素的應用價值越來越備受關注。

L.pentosusWH12-2-1是從內蒙古傳統乳制品中分離出的一株具有抑制食品腐敗和致病菌生長的微生物。本研究對L.pentosusWH12-2-1產生細菌素的培養條件和培養基成分進行優化，從而使其細菌素產量最大化。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

菌株L.pentosusWH12-2-1，指示菌蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereusAS 1.1846），均由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

LB液體培養基 （Luria-Bertani Broth）、MRS液體培養基、酸性對照培養基（用乳酸調整的與細菌素初提液pH值相同的空白培養基）。

1.2 細菌素粗提液的制備

將L.pentosusWH12-2-1菌株于滅菌脫脂乳中－80℃保存，使用前，接種于MRS培養基，37℃培養16～18 h，活化兩代后，按質量分數為2%的接種量接種到MRS培養基中，37℃培養24 h，最后一代經MRS培養基培養36 h。培養液于3 000 g離心15 min，取上清液用無菌濾菌器（0.22 μm）過濾除菌即得細菌素粗提液，保存于4℃冰箱備用。

1.3 抑菌活性檢測方法

采用牛津杯法。在直徑為9 cm的培養皿中準確加入20 mL MRS固體培養基,待凝固后，吸取100 μL指示菌稀釋液（活菌數為2.0×106mL-1）于固體培養基中，用滅菌推棒涂抹均勻，在每個平皿中等距離放置牛津杯，并在牛津杯中加入100 μL細菌素粗提液,于30℃培養14 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。毎個試驗設酸性對照，并設3組平行，求平均值。

1.4 不同培養溫度和起始pH值對細菌素產量的影響

將L.pentosusWH12-2-1以質量分數為2%的接種量接種于MRS液體培養基中，分別于15，25，30，37，45℃培養48 h后，按照方法2.2制備細菌素粗提液，按照方法2.3測定抑菌活性。

用濃度為0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液將液體MRS培養基的pH值分別調至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，滅菌后以質量分數為2%的接種量接入L.pentosusWH12-2-1，37℃培養48 h后，按照方法2.2制備細菌素粗提液，按照方法2.3測定抑菌活性。

1.5 培養基碳源和氮源的篩選

不同的碳源和氮源分別取代MRS中的碳源和氮源配制培養基，接種L.pentosusWH12-2-1進行培養，根據抑菌圈的直徑確定碳源和氮源的優劣。優選的氮源按照不同的添加比例進行復配。

1.6 培養基碳氮量及碳氮比的優化

在上一步優化的培養基基礎上，分別用不同的碳氮總量和碳氮質量比取代MRS中的碳源和氮源配制培養基，接種L.pentosusWH12-2-1進行培養，以抑菌圈的直徑大小確定適宜的碳氮總量和碳氮比例。

1.7 培養基微量元素的優化

以優化的碳源和氮源培養基為基礎，添加不同的微量元素(包括鎂、錳、鐵、)，分別設酸性對照，接種L.pentosusWH12-2-1進行培養，以抑菌圈的直徑大小確定微量元素的添加量。

1.8 培養基緩沖體系的優化

以優化了碳源、氮源、微量元素的培養基為基礎，添加不同的緩沖鹽體系，設酸性對照，確定最優的緩沖體系。

1.9 培養基組分構成比例的優化

由培養基營養成分篩選確定的L.pentosusWH12-2-1生長的主要影響因素包括碳源、氮源和緩沖鹽，設計三因素正交旋轉回歸實驗。以細菌素粗提液的抑菌圈直徑為響應值做響應面設計，對營養成分進行優化，得到優化培養基。

2 結果與討論

2.1 培養溫度對細菌素產量的影響

圖1為培養溫度對細菌素產量的影響。

由圖1可以看出，L.pentosusWH12-2-1在培養溫度為37℃時，抑菌圈直徑最大，可達（21.57±0.48）mm，酸性對照為（15.27±0.53）mm，說明此溫度下細菌素產量最大；當培養溫度降至15℃時，細菌素的產量明顯下降，45℃時無細菌素產生，這是由于L.pentosusWH12-2-1在45℃生長受到限制，進而影響到細菌素的合成。已有報道乳酸菌產細菌素是一個對溫度敏感的過程[4]。Luca Settanni等[5]研究發現溫度對Enterococcus mundtii strains的抑菌物質活性沒有強烈的影響，在30℃時，抑菌物質的活性最高。Ogunbanwo ST等[5]對Lactobacillus brevisOG1研究表明，30℃時最有利于細菌素的合成，菌體生長最好；而45℃時，菌體即停止生長和合成細菌素。本研究選擇培養溫度37℃進行下一步實驗。

2.2 起始pH值對細菌素產量的影響

pH值對細菌素產量的影響，是因為pH值能夠調控合成細菌素的基因，目前，幾個典型的可被調控的基因已被發現[6]。圖2為起始pH值對細菌素產量的影響。

由圖2可以看出，在起始pH值7.0的條件下，細菌素活力最強，抑菌圈直徑可達（22.46±0.23）mm，酸性對照為（14.92±0.25）mm。結果與Van den Berghe[7]等研究E.faeciumFAIR-E 406在起始中性條件下能持續產生最大量的細菌素相似。中性pH值范圍被認為是腸球菌產生最大細菌素量的最佳條件[8]。故選擇pH值為7.0進行下一步實驗。

2.3 培養基碳源優化

表1為L.pentosusWH12-2-1在不同碳源培養基中的抑菌圈直徑。

由表1可以看出，經顯著性分析可知，葡萄糖最有利于細菌素的產生，D-麥芽糖次之，蔗糖、乳糖的效果一般,可溶性淀粉最差,可能是不同的碳源提供的能量和碳骨架不同，影響了細菌素的合成。故選擇葡萄糖為最佳的碳源。

表1 在不同碳源培養基中的抑菌圈直徑

2.4 培養基氮源的優化

有機氮源的種類影響細菌素的產量，這可能與細菌素的合成機制有關，或許是不同氮源中的某些成分誘導了細菌素合成基因的啟動[9]。由于乳酸菌其自身酶構成簡單，許多氨基酸不能自身合成[10]，故本實驗選擇有機氮源進行實驗。表2為L.pentosus WH12-2-1在不同氮源培養基中豆的抑菌圈直徑。

表2 在不同氮源培養基中豆的抑菌圈直徑

由表2顯著性分析可知，酵母粉最有利于L.pentosus WH12-2-1細菌素的產生，大豆蛋白胨和牛肉膏僅次之，胰蛋白胨和牛蛋白胨的效果最差。故選擇酵母粉為最適宜的氮源。酵母粉中除含有豐富的氨基酸外還含有許多維生素和無機鹽[11]，許多對乳酸菌培養基的研究都表明酵母粉是最適宜的氮源[12，13]。

考慮到僅以酵母粉作為氮源成本較高，因此選擇價格低廉，促進生長效果僅次于酵母粉的大豆蛋白胨、牛肉膏與酵母粉復合使用作為氮源。由表2可以看出，氮源的復合使用要比單獨使用效果明顯，故選擇酵母粉︰大豆蛋白胨︰牛肉膏為1︰2︰1為復合氮源，添加質量分數為1%進行下一步實驗，結果如表3所示。

2.5 培養基碳氮質量及碳氮量比的優化

培養基中碳氮比例對微生物生長繁殖和產物合成的影響極為顯著。氮源過多則會使菌體生長過于旺盛，容易引起菌體的衰老和自溶；碳源過多則容易形成較低的pH值，不利于菌體生長[14]。

圖3為不同碳氮質量比和碳氮量對細菌素產量的影響。由圖3可以看出，培養基的碳氮質量比對細菌素產量的影響隨碳氮量的變化而變化，均為先增大后減小，但是最佳比例卻不相同。當碳氮量質量分數為3%時，抑菌圈直徑在碳氮比為3時出現最大值；當碳氮質量分數為4%和5%時，抑菌圈直徑均在碳氮比為2時出現最大值，而當碳氮質量分數為6%時，抑菌圈直徑則是在碳氮比為1時出現最大值。綜合考慮選擇碳氮質量分數為4%、碳氮質量比為2進行下一步研究。

表3 復配氮源及添加量對細菌素產量的影響

注：抑菌圈直徑單位為mm。(下同)

2.6 培養基緩沖鹽體系的優化

緩沖鹽體系中的某些無機鹽是微生物細胞的組成成分或代謝調節物，如磷、硫是細胞質的組成成分，鉀、鈉有維持水平衡、保持滲透壓和酸堿平衡的作用[15]。常用的緩沖劑有檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等。表4為不同緩沖鹽體系及其添加量對細菌素產量的影響。

由表4可以看出，培養基中補充一定的緩沖鹽后細菌素的產量明顯高于空白對照組。經過不同緩沖鹽體系對細菌素產量影響的顯著性分析，可知體系C6H5Na3O7-K2HPO4-CH3COONa、Na2HPO4-NaH2PO4和Na2HPO4-KH2PO4對細菌素產量的影響差異不顯著，而他們都與體系C6H8O7-C6H5Na3O7差異顯著。其中，以C6H5Na3O7-K2HPO4-CH3COONa體系的平均水平最高，且在濃度為0.1mol/L的情況下，細菌素的產量最大。故選擇C6H5Na3O7-K2HPO4-CH3COONa體系進行下一步實驗。

2.7 培養基微量元素的優化

圖4為微量元素對細菌素產量的影響。由圖4可以看出，MgSO4，MnSO4和 FeSO4對細菌素的產生都有一定的促進作用，且隨著微量元素添加量的增大，細菌素的產量都經歷了由增到減的過程。Vlaemynck[16]發現在培養基中將MgSO4替換為MgCl2或K2SO4,還有或在MgSO4存在的基礎上添加不同濃度的這些鹽類（Mg-Cl2或K2SO4）會對細菌生長和細菌素產量有一定的影響。Hugas[17]發現錳離子可以提高Lb.sakei CTC 494細菌素的活性。故確定MgSO4的添加量為1000 mg/L,MnSO4的添加量為50 mg/L，FeSO4的添加量為50 mg/L。

表4 不同緩沖鹽體系及其添加量對細菌素產量的影響

2.8 Tween-80添加量的選擇

Tween-80作為一種乳化劑，可以降低菌體細胞與培養基接觸面之間的表面張力，從而改善細胞膜的通透性，減弱細胞對細菌素的吸附作用，使細菌素更多的釋放到培養基中,從而使細菌素產量增加[18]。除此之外，Tween-80可能為細胞的生[19]長提供某些脂肪酸，也可能是作為一種類似維生素的物質，有助于細菌素的產生。而過量的Tween-80則會與硫酸鹽反應形成沉淀，使純化工藝的難度加大[20]。 因此，選擇合適質量分數的Tween-80對細菌素的產生和后面的純化工作都至關重要。圖5為Tween-80對細菌素產量的影響。

由圖5可以看出，在培養基中添加不同質量分數的Tween-80對L.pentosus WH12-2-1細菌素的產生有不同程度的影響，其中，添加質量分數為0.2%的Tween-80最有利于細菌素的產生。故確定Tween-80的添加量為0.2%。

2.9 對培養基主要組成成分的優化

響應面法 (Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的試驗設計并通過實驗得到的一定數據，采用多元回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法[21]。與單因素設計和正交實驗設計相比，它通過建立數學模型，可以在更廣泛的范圍內考慮因素的組合并預測響應值；同時對影響生物產量的各因子水平及其交互作用進行優化與評價，快速有效地確定多因子系統的最佳條件[22]。因此被廣泛用于發酵培養基的優化工作。

本研究采用響應面中心組合設計方案的三因素二次正交旋轉設計對已選定的培養基成分中的主要營養成分碳源、氮源和緩沖鹽含量進行優化，以細菌素抑菌圈直徑為響應值尋求最適宜的各培養基成分配方。具體實驗因素水平設計和實驗結果如表5所示。

用Design Expert軟件對表4數據進行多項回歸分析，得到L.pentosus WH12-2-1細菌素粗提液的抑菌圈直徑(Y)對碳源x1，氮源x2，緩沖鹽x3的多項回歸方程為

表5 三因素二次正交旋轉回歸設計及實驗結果

式中：Y為抑菌圈直徑的預測值；x1，x2，x3分別為碳源、氮源和緩沖鹽對應的編碼值。方差分析表明該模型極顯著(P＝0.0010)，模型確定系數R2=0.9750，校正系數R2=0.9207，這表明模型與實際情況擬合較好。因此，該模型可用于預測菌株L.pentosusWH12-2-1產細菌素的情況。碳源，氮源，緩沖鹽交互作用對細菌素產量的影響變化趨勢，如圖6所示。

圖6（a）中，緩沖鹽濃度為0.13 mol/L，碳源－氮源交互作用；（b）中，氮源質量濃度為15 g/L，碳源－緩沖鹽交互作用；（c）中，碳源質量濃度為30 g/L，氮源－緩沖鹽交互作用。

由圖6可以看出，碳源和氮源交互作用的響應曲面是有明顯曲率的，說明碳源、氮源對細菌素的產量是有交互作用的，從而進一步驗證了前期設計碳氮總量及碳氮比例的試驗是有必要的。

求解方程極值得到預測最優培養基配方為：碳源x1=32.71 g/L，氮源x2=18.25 g/L，緩沖鹽x3=0.14 mol/L，預測最大抑菌圈直徑為32.95 mm。考慮到實際操作性，將優化參數修正為：碳源30 g/L，氮源20 g/L，緩沖鹽0.15 mol/L，在此條件下，預測最大抑菌圈直徑為32.45 mm。經實驗驗證，實際測得抑菌圈直徑為（31.72±0.17）mm， 與模型預測值擬合率達97.75%，酸性對照為（13.14±0.25）mm。從驗證實驗的效果來看，該預測方程可靠。

3 結 論

經過對L.pentosusWH12-2-1產細菌素的條件優化后，在37℃（pH值為7.0）條件下,最佳培養基配方為大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖30 g/L，檸檬酸鈉6 g/L，磷酸氫二鉀6 g/L，乙酸鈉15 g/L，Tween-80 2g/L，硫酸鎂1 g/L，硫酸錳50 mg/L，硫酸亞鐵50 mg/L。經過培養基成分的優化，抑菌圈直徑可達（31.72±0.17）mm，酸性對照為（13.14±0.25）mm，排除酸性物質的影響，其抑菌活性是優化前的3.38倍。

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Optimation of condition of bacteriocin production by Lactobacillus pentosus WH12-2-1

SU Fang,LI Li,LUO Bin,Menghebilige
(Key Lab of Dairy Biotechnology and Bioengineer of Education Ministry of China,college of food science and engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

As one strain was isolated from traditional fermented dairy product of Inner Mongolia,Lactobacillus pentosus WH12-2-1 was investigated for its optimal condition of bacteriocin production.Medium components such as carbon and nitrogen sources and cultivation condition were optimized,the optimal concentration of buffer salt,carbon and nitrogen sources were determined by using response surface method.The results showed that Lactobacillus pentosus WH12-2-1 optimal culture medium components was consist of 10 g/L soy peptone,5 g/L beef extract,5 g/L yeast extract,30 g/L glucose,6 g/L sodium citrate,6 g/L K2HPO4,15 g/L CH3COONa,2 g/L Tween-80,1 g/L Mg-SO4,50 mg/L MnSO4and 50mg/L FeSO4at 37℃with start pH 7.0.Under optimized condition,Lactobacillus pentosus WH12-2-1 produced 3.38-fold higher amount of bacteriocin than the un-optimized condition.

L.pentosus WH12-2-1；Bacteriocin；Optimation

Q93-335

A

1001-2230（2010）03-0010-06

2009-11-11

蘇芳（1986-），女，碩士研究生，從事食品微生物與發酵工程的研究。

孟和畢力格