Tetramer技術檢測人乳頭瘤病毒抗原特異性T細胞條件的優化

王雪蓮,王冬冬,谷秋紅,李 維,安春麗

(1.中國醫科大學病原生物學教研室,遼寧沈陽 110001;2.中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科,遼寧沈陽 110004;3.中國醫科大學附屬盛京醫院感染科,遼寧沈陽 110004;4.中國醫科大學附屬第一醫院兒科,遼寧沈陽 110001)

臨床流行病學和分子流行病學研究結果表明,人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宮頸癌發生的首要因素。幾乎所有的宮頸癌及其前體病變(鱗狀上皮內瘤變)中均可檢測到HPV DNA[1-2],并以高危型HPV16最為常見,占50%以上[2]。高危型HPV編碼的早期蛋白E6、E7是宮頸癌發生的關鍵因子,在HPV誘導腫瘤形成及維持腫瘤細胞惡性表型過程中發揮至關重要的作用[2-3]。二者持續表達在所有宮頸癌細胞中,是宮頸癌的特異性蛋白。研究證實,E6、E7蛋白具有免疫原性,針對這兩個蛋白的特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)在清除HPV感染細胞和病毒轉化形成的腫瘤細胞過程中發揮重要作用,因此檢測體內HPV特異性CTL的頻數和功能有助于了解病毒感染者或宮頸癌患者體內的特異性細胞免疫反應,以及疫苗的免疫效果。本研究利用加載HPV16 E6表位抗原肽(E6 133-142;HN I RGRWTGR)的HLAA6801四聚體(Tetramer),即HPV16 E6 133-142/HLA-A6801-PE Tetramer,通過檢測含有HPV特異性CTL的PBMC標本,優化Tetramer染色的實驗條件,探討染色的最佳溫度及Tetramer濃度,為進一步檢測HPV感染者或宮頸癌患者體內抗原特異性的CTL打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HPV抗原特異性的CTL 取HPV感染后病毒自發清除者外周血,Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC),免疫磁珠法分離CD8+T細胞,HPV16 E6蛋白體外刺激后,有限稀釋法篩選T細胞克隆,EL ISPOT、51Cr釋放實驗證實為HPV16 E6 133-142特異性的CTL,遞呈抗原的HLA分子為HLA-A6801[4]。

1.1.2 主要試劑 四聚體HPV16 E6 133-142/HLA-A6801-PE由美國N IH Tetramer facility合成;熒光標記抗體anti-CD3-PerCP,anti-CD8-Alex,anti-CD4-FITC,anti-CD14-FITC,anti-CD19-FITC,anti-CD8-PerCP,anti-CD45RO-allophycocyanin(APC)購自BD Biosciences公司;淋巴細胞分離液Ficoll、RPM I1640、FBS、BSA及sodium azide為Fisher Scientific產品;流式細胞儀Becton Dickinson FACSCalibur為BD Bioscience公司產品。

1.2 方法

1.2.1 PBMC制備及HLA分型 靜脈采集未感染HPV的健康自愿者全血200 mL,Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。取2×107PBMC,免疫磁珠法分離CD3-細胞,EB病毒轉化形成永生化的B淋巴母細胞系(EBV-transfor med lymphoblastoid B cell line,EBV-LCL),應用序列特異性引物PCR進行HLA分型(由美國UAMS HLA實驗室完成)。選用HLA型別為HLA-A6801陰性的PBMC用于進一步的實驗。

1.2.2 細胞染色及檢測 ①細胞準備：收集HPV特異性的CTL及HLA-A6801陰性的PBMC,RP-5F調整細胞濃度為2×107個/mL或4×107個/mL,使每一染色樣本中細胞總數為1×106。混合HPV特異性CTL及PBMC作為陽性標本(CTL與PBMC比例約為95∶5)。單獨PBMC作為陰性標本;②細胞染色及檢測：為探討在Tetramer用量及染色時間一定條件下,不同溫度對染色效果的影響,以及在溫度及染色時間一定條件下,不同Tetramer稀釋度對染色效果的影響,分別按表1和表2進行細胞染色。

表1 探討溫度對染色效果的影響Table 1 To investigate the effect of temperature on staining

先加Tetramer于細胞懸液中,再加其他抗體,RP-5F補足體積為100μL,混勻,避光孵育30 min。PBS(含0.2%BSA,0.02%sodium azide)洗細胞3次,將細胞重懸于含1%for malin的PBS中,流式細胞儀Becton Dickinson FACSCalibur(BD Bioscience)檢測。每個樣本檢測1×105細胞,數據用Cell Quest軟件分析。Tetramer/CD8雙陽性的T細胞為HPV特異性的CTL細胞。

表2 探討Tetramer濃度對染色效果的影響Table 2 To investigate the effect of titration of Tetramer on staining

2 結 果

2.1 溫度對染色效果的影響

首先使用Tetramer-PE、anti-CD3-PerCP、anti-CD8-Alex及anti-CD45RO-APC進行染色。參考N IH推薦,以1∶400稀釋的Tetramer染色30 min,比較3個不同溫度(4℃、室溫(約21℃)及37℃)的染色效果,以確定最佳的染色溫度。結果顯示,在3個溫度下,陽性標本中HPV特異性CTL陽性的百分比相似,分別為0.27%、0.26%、0.23%,CD8-T細胞被非特異性染色的比率較低,分別為0.05%、0.05%、0.06%,見圖1。陰性標本中非特異性染色均在0.01%以下,見圖2。為方便操作,選擇室溫(約20℃)為染色溫度,進行后續的實驗。

2.2 Tetramer稀釋度對染色效果的影響

為排除可能發生非特異性結合的CD8-細胞,如單核細胞、CD4-T細胞、B細胞等,使用anti-CD4-FITC、anti-CD14-FITC、anti-CD19-FITC抗體進行染色,并檢測CD4/14/19陰性區的PerCP、PE、APC熒光強度。在室溫染色30 min條件下,比較4個Tetramer稀釋度(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600)的染色效果,以確定最佳的Tet-ramer用量。結果顯示,4個Tetramer稀釋度條件下,陽性標本中HPV特異性CTL均集中在高熒光強度區域,陽性百分比分別為1.88%、2.03%、1.89%、2.10%,CD8-T細胞被非特異性染色的比率分別為0.12%、0.05%、0.03%、0.02%,見圖3。陰性標本中非特異性染色均在0.01%或以下,見圖4。結果表明Tetramer稀釋度為1∶1 600時,可獲得最佳特異性CTL染色效果,即染色的CTL熒光強度保持高水平,且非特異性染色少。

3 討 論

Tetramer技術是近年發展起來的一種檢測抗原特異性T細胞的工具。其原理是基于T細胞上表位特異性受體(TCR)對抗原遞呈細胞(APC)/靶細胞表面的主要組織相容性復合體(MHC)分子-肽復合物的精確識別。Tetramer由1個分子的鏈親素與4個分子的生物素化MHC-抗原肽連接形成組成,能夠同時結合多個TCR,顯著提高其與特異性T細胞的親和力,從而大大提高了抗原特異性T細胞檢測的敏感性。自1996年Altman[5]首次應用MHC-肽四聚體技術檢測H IV抗原特異性的CTL及其前體細胞以來,該技術作為直觀、定量檢測抗原特異性T細胞的工具,已成為定量檢測特異性CD8+T細胞的金標準,并廣泛用于病毒感染[4,6-7]、腫瘤[8]及自身免疫性疾病[9]的研究。

研究證實,對某一MHC-抗原肽復合體具有特異識別作用的CTL在外周血淋巴細胞中的比率很低,大多在1%以下[4,10-11]。對于僅感染局部的皮膚和黏膜上皮細胞的HPV更是如此[4],因此檢測這些低頻率的特異性CTLs不僅需要有高敏感度的方法,如Tetramer技術,還需要優化染色條件,增加流式細胞儀檢測的目標信號/噪音信號比,進而獲得可靠的實驗結果。

本研究從2個方面優化實驗條件：①使用目標細胞群陰性的抗體,試驗選擇了anti-CD4-FITC、anti-CD14-FITC、anti-CD19-FITC,用以排除可能發生非特異性接合的單核細胞、CD4-T細胞、B細胞等;②選擇理想Tetramer的濃度和孵育溫度。通過檢測含有已經證實為HPV16 E6 133-142表位特異性CTL的標本,分析不同Tetramer稀釋度和不同孵育溫度條件下,Tetramer與特異性CTL表面TCR的結合情況,以確定最佳染色條件。結果表明,4℃、室溫(約20℃)及37℃條件下,Tetramer染色的敏感性和特異性無明顯差異,染色溫度對Tetramer與CTL的結合無明顯影響。此結果與查慶兵等[12]報道一致。Whelan JA等[13]研究發現,包含不能引起細胞免疫反應的變異肽的Tetramer在4℃時能使CTL著色,但在37℃卻不能。Whelan認為,4℃染色檢測到的T細胞可能與免疫反應相關性小,因而建議在37℃染色,以提高CTL染色的特異性。以上表明,在進行標本染色前,應進行預實驗,根據具體情況選擇合適的染色溫度。

Tetramer稀釋度對染色影響結果顯示：當Tetramer濃度不斷下降,HPV特異性CTL的染色熒光強度逐漸下降,同時CD8-T細胞的非特異性染色也逐漸減少,但HPV特異性CTL陽性率基本保持不變。本研究結果為進一步檢測HPV感染后機體產生的抗原特異性的細胞免疫反應及研究疫苗的接種效果打下堅實的基礎。

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