耐多藥結核桿菌對二線抗結核藥物的敏感性實驗研究

胡冬華 ，歐陽福桂，李 鷹 ，李 琴，王祖康，劉 瓊

(1江西省萍鄉市第三人民醫院，江西 萍鄉 337000；2、江西省萍鄉市湘雅萍礦合作醫院，江西 萍鄉 337000)

耐多藥結核桿菌對二線抗結核藥物的敏感性實驗研究

胡冬華1，歐陽福桂2，李 鷹1，李 琴1，王祖康1，劉 瓊1

(1江西省萍鄉市第三人民醫院，江西 萍鄉 337000；2、江西省萍鄉市湘雅萍礦合作醫院，江西 萍鄉 337000)

目的明確耐多藥結核桿菌對部分二線抗結核藥物的敏感性，為治愈耐多藥結核病提供依據。方法選用改良羅氏培養基，采用藥敏比例法測定耐多藥結核菌對卷曲霉素、丁胺卡那、左旋氧氟沙星、對氨基水楊酸此四種臨床常用二線抗結核藥物的敏感性。結果22株耐多藥結核分枝桿菌對卷曲霉素、丁胺卡那、左旋氧氟沙星、對氨基水楊酸的敏感率依次為：72.7%、90.9%、63.6%、45.5%。結論本地區耐多藥結核菌對對氨基水楊酸敏感率較低，對其它三種二線抗結核藥還處于低水平耐藥狀態，但已出現廣泛耐藥結核桿菌菌株，應予重視。

結核桿菌；耐多藥；二線抗結核藥物

近年來，耐藥結核病尤其是耐多藥結核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB) 和廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDRTB)的流行與傳播引起了全球各國學者的極大關注，耐藥結核病的治療已成為結核病控制工作中亟待解決的難題[1-5]。耐多藥結核病是指結核病患者至少包括對異煙肼和利福平耐藥者，廣泛耐藥結核病是指在MDR-TB的基礎上，還對氟喹諾酮類藥物中的一種以及至少對以下三種注射藥物：卷曲霉素(Cm)、卡那霉素(Km)和丁胺卡那霉素(Amk)中的一種產生耐藥的結核病[1-3]。XDR-TB是目前最為嚴重的一種結核病，治愈率很低，病死率極高[5]。為掌握本地區耐多藥結核菌對部分二線抗結核藥物的敏感率及確認廣泛耐藥結核菌的存在狀態，以便更及時有效地治愈好耐多藥結核患者，更有效地控制耐多藥、廣泛耐藥結核病的傳播流行，我們對自2008年12月份至2010年5月份培養分離出的22株耐多藥結核分枝桿菌進行了四種二線抗結核藥物的藥物敏感實驗研究，現將研究結果報告如下。

材料與方法

1 材料

1.1 標本

22 例耐多藥結核分枝桿菌標本，來自于2008年12月至2010年5月萍鄉市第三人民醫院門診及住院的結核感染復治患者，其中男性患者15例，女性患者7例，年齡分別為27至60歲。經痰標本結核菌培養及一線藥物敏感實驗表現為同時對異煙肼及利福平此兩種藥物耐藥，符合耐多藥結核菌感染定義。

1.2 儀器

生物安全柜BIOSAfe12Ⅱ.A2購自上海力申科學儀器有限公司，37℃恒溫培養箱購自湖北黃石市醫療器械廠。

1.3 試劑

含對氨基水楊酸(PAS)，左旋氧氟沙星(LOF)，硫酸阿米卡星(AMK)，硫酸卷曲霉素(CPM)藥敏培養基及中性改良羅氏(L-J)培養基購自臺灣貝索(BASO)公司。

1.4 結核分枝桿菌標準菌株H37 RV由江西省胸科醫院檢驗科提供。

2 方法

2.1 標本處理

將22株于對異煙肼及利福平同時耐藥的培養保存的陽性結核菌株，復蘇接種至羅氏培養基上培養25d。

2.2 藥物敏感實驗

采用比例法：對上述菌種復蘇培養25d后，挑取培養基上菌落，用無菌0.5%TWEEN80生理鹽水溶解、稀釋，與標準麥氏比濁管(MacFarland No.1)比濁，即制成1 mg/ml菌懸液，繼而稀釋至10-2和10-4mg/ml，分別用標準接種環(0.07mm粗的金屬絲制成的內徑3mm的接種環，1環可轉移菌液0.01ml)以劃線法接種至對照及含藥培養基斜面。

2.3 結果判斷

37 ℃培養4周后觀察結果并計算耐藥百分比(耐藥百分比＝(含藥培養基上菌落數)/(對照培養基上菌落數)×100%，＜1%者報告敏感 (S)，≥1%者報告耐藥(R)。

2.4 統計學分析

患者的資料來源于本院門診及住院病歷，標本的實驗室檢測數據來自實驗記錄，結果的統計采用Microsoft Excel，藥物敏感性分析實用 WHO的SDRTB4結核病耐藥檢測軟件，統計耐藥率及95%可信區間(95%C1)。

結 果

1 22 株耐多藥結核菌對四種二線抗結核單種藥物敏感率結果見表1。

2 22 株耐多藥結核菌對四種二線抗結核藥物敏感試驗多種藥物耐藥率結果見表2。

討 論

表1 單種藥物敏感率

表2 藥物敏感試驗多種藥物耐藥結果

WHO 2008年報道顯示，全球結核病總耐藥率為20.0%，耐多藥率為5.3%，估計全球MDR-TB為50萬例，其中有三分之一已死亡，被WHO認定的27個MDR-TB、XDR-TB高負擔國家占了病例總數的85%[6-7]。我國有500萬肺結核患者，占全球患者總數的1/4，每年新發傳染性結核病人150萬，每年大約有13萬人死于結核病。每年新發生耐多藥結核病患者12萬人，廣泛耐藥患者近1萬，結核在我國的流行危害已遠遠超過艾滋病及其它傳染病的威脅。

本實驗結果表明，萍鄉地區耐多藥結核菌對二線抗結核藥物的敏感性總體上還保持在較高水平，其敏感性表現從高到低依次為丁胺卡那、卷曲霉素、左旋氧氟沙星、對氨基水楊酸。作者通過走訪調查實驗組22例患者的病程情況及病歷資料發現，22例患者的治療方案都沒有嚴格參照1998年我國制定的標準耐多藥治療方案，基于培養時間等原因，有的也沒有參照我們的藥敏實驗研究結果。所有患者中，有近60%的患者因癥狀復發而重新入院或轉入其他醫院就診住院治療。因此，對于治愈耐多藥結核患者，明確的診斷，合理規范的治療都有賴于結核菌的培養及相應的藥物敏感實驗及有力的經濟保障。治療的不規范使得普通的結核病轉變成耐多藥結核，在更加惡劣的情形下，耐多藥結核進一步轉變為廣泛耐多藥結核。由于對目前絕大部分一線、二線抗結核藥物均有耐藥性，廣泛耐藥結核幾乎成為不治之癥。

綜合本實驗結果及患者的臨床表現、抗結核治療用藥過程，作者認為本文中有六例患者符合廣泛耐藥結核病(XDR-TB)感染診斷，該六例患者均為結核感染后久治不愈、病程遷延達4～9年，反復多次住院治療者，藥敏結果表現在同時耐異煙肼、利福平、左旋氧氟沙星該三種藥物的基礎上對卷曲霉素或丁胺卡那耐藥。該結果基本符合作者在一線藥物敏感試驗中得出的推斷[8]。廣泛耐藥結核感染率占22例耐多藥結核標本的27.3%，占總數44例結核培養陽性標本的13.6%。

鑒于此次是本地區首次開展二線抗結核藥物敏感試驗，該批標本篩選自80例結核感染患者，其中82%為結核復治患者，因此陽性率存在被統計高估的可能。但出現了典型的近似于不治之癥且極具傳播感染威脅的廣泛耐藥結核感染患者，應引起抗結核治療專家及主管部門的高度重視。對于初治患者貫徹DOTS治療，不僅可治愈95%以上的患者，治療時間、經濟成本也較低。對于耐多藥結核病(MDRTB)患者則應選用敏感的二線抗結核藥物，參照國家的耐多藥結核病治療原則組合治療，阻止其發展為廣泛耐藥結核病(XDR-TB)。我們開展二線藥物敏感實驗，只是為耐多藥結核病治療提供了相應的藥物敏感數據，使得臨床耐多藥結核病治療的藥物組合有科學依據，以期提高其治愈率并控制其在本地區的感染流行嚴重趨勢。但是，同樣高昂的培養藥敏實驗費用也使更多貧困的耐多藥結核病患者及臨床醫生望而卻步，從而無法確診認定出泛耐藥結核病患者，也使耐多藥結核病患者的治療更難控制而轉變為廣泛耐藥結核病。為此，作者期待本文研究能引起主管部門對耐多藥、尤其是廣泛耐藥的結核患者投入更多經濟、技術及政策上的支持，給結核患者更多的關懷，真正有效的控制結核病、耐藥結核病的流行傳播。

[1]唐神結,肖和平.嚴重耐多藥結核病的成因與對策[J].中華臨床醫師雜志,2009,3(3):460-466.

[2]唐神結.耐藥結核病防治手冊[M].北京:人民衛生出版社,2009:44-150.

[3]World Health Organization.Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis:emergency update 2008[M].Geneva：World Health Organization,2008:4-6.

[4]Chiang CY,Yew WW.Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis[J].Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(3):304-311.

[5]Gandhi NR,Shah NS,Andrews JR,et al.HIV coinfection in multidrug-and extensively drug-resistant tuberculosis results in high early mortality[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,181(1):80-86.

[6]World Health Organization.Global tuberculosis control：epidemiology，strategy，financing：WHO report 2009[M].Geneva:World Health Organization,2008:1.

[7]World Health Organization.Anti-tuberculosis drug resistance in the world fourth global report[M].Geneva:WHO Press,2008:14-17.

[8]胡冬華,李 琴,王祖康,等.萍鄉地區44株結核分枝桿菌藥物敏感試驗結果分析[J].實驗與檢驗醫學雜志,2010,28(2):137-138.

The experimental study on susceptibility of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis to secondline anti-TB drugs

HU Donghua,OUYANG Fugui,LI Ying,et al.Pingxiang Third People’s Hospital,Jiangxi Pingxiang 337000,China

ObjectiveTo understand the susceptibility of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis to second-line anti-TB drugs for clinical treatment.MethodsThe susceptibility to CPM,AMK,PAS and LOF for multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis was tested by the reformed L-J culture media and proportional method.ResultsThe susceptibility of 22 strains showed CPM was 72.7%,and with 90.9%of AMK,63.6%of LOF,45.5%of PAS,respectively.Conclusions The rate of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis retains a higher level against PAS,and at lower levels against LOF,AMK,CPM in our area.However,extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains should be noticed in clinical treatment.

Mycobacterium tuberculosis;Multi-drug resistance;Second-line anti-TB drug

R378.91+1,R446.5,R521,R825.2,Q939.92

A

1674-1129(2010)06-0543-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.06.004

江西省萍鄉市科技局2010年科研立項課題。

胡冬華，女，1977年生，本科學歷，主管檢驗師，主要從事臨床微生物學檢驗及研究。