加味四逆散對(duì)腸易激綜合征大鼠不同腦區(qū)核團(tuán)c-fos蛋白表達(dá)的影響

白 霞,謝小磊,李 夢(mèng),耿建國(guó),李冬華,杜宇瓊

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京 100069)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一種常見的消化系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),腸易激綜合征的發(fā)病與慢性心理應(yīng)激引起的腦腸軸功能紊亂密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為,腸易激綜合征肝脾失和是發(fā)病關(guān)鍵,治療應(yīng)以疏肝健脾為主。本試驗(yàn)旨在研究加味四逆散方對(duì)腸易激綜合征大鼠不同腦區(qū)核團(tuán)c-fos蛋白表達(dá)的影響,探討加味四逆散方對(duì)大鼠腦腸軸調(diào)控機(jī)制作用,為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠 24只,清潔級(jí),雄性,體重 180g～220g,購于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,動(dòng)物合格證號(hào) SCXK-(軍)2007-004。正常光照條件,食、水可自由攝取,室溫控制在 18℃～22℃之間。

1.2 藥物

加味四逆散由柴胡 10g、白芍 10g、枳實(shí) 10g、炙甘草 10g、炒白術(shù) 10g等組成,藥材購自北京國(guó)醫(yī)堂大藥店,加味四逆散煎煮、過濾、濃縮、配制成濃度為1.35g/m L。陽性對(duì)照藥:匹維溴銨片(得舒特片),批號(hào) 610996,將藥片碾碎后溶于蒸餾水配制成懸浮液,濃度為 1.79mg/m L。藥物制備后,分別在 4℃冰箱保存。

1.3 主要試劑及儀器

灌注泵(保定蘭格恒流泵有限公司,BT00-100M),免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),光學(xué)顯微鏡(Leica DMLA),圖文分析軟件(Leica Qwin)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備

按文獻(xiàn)方法改進(jìn),采用束縛制動(dòng)加灌服番瀉葉改良的方法,制備腸易激綜合征動(dòng)物模型。將造模大鼠置于制動(dòng)筒內(nèi)(自制),通過移動(dòng)插片而逐步縮小大鼠的活動(dòng)空間,調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度,每日制動(dòng) 1次。每日開始時(shí)間及制動(dòng)時(shí)間不同,第 1天為 4h,其后每次增加 30min～60min,造模大鼠在制動(dòng)期間禁食、禁水。束縛制動(dòng)后給予番瀉葉煎劑(0.3g/ml)灌胃(20ml/Kg),每日 1次,連續(xù)21d。

2.2 分組及給藥

將造模成功的大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組、加味四逆散組、得舒特組共 3組,每組 6只。加味四逆散組灌服加味四逆散濃縮液 10.9g/(kg·d),得舒特組灌服得舒特懸浮液 32.14mg/(kg·d),連續(xù) 21d,同時(shí)正常對(duì)照組及模型對(duì)照組大鼠灌以蒸餾水20ml/(kg· d),連續(xù) 21d。

2.3 檢測(cè)方法

2.3.1 大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能 大鼠實(shí)驗(yàn)前 24h禁食,給予 30%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉,取直徑為 3mm的玻璃小球沿肛門放入距肛門 3cm的直腸內(nèi)。大鼠蘇醒后迅速移至籠內(nèi)喂食飲水,籠內(nèi)墊清潔濾紙。觀察 2h內(nèi)大鼠排便的糞點(diǎn)數(shù)和直腸內(nèi)玻璃小球排出時(shí)間。

2.3.2 大鼠小腸運(yùn)動(dòng)功能 大鼠以 50%墨汁灌胃(2ml/只),10min后處死。剖取小腸,測(cè)量小腸墨汁推進(jìn)百分率(推進(jìn)率(%)=幽門至墨汁前沿的距離/幽門至回盲部的距離 ×100%)。

2.3.3 不同腦區(qū)核團(tuán) c-fos蛋白表達(dá)的測(cè)定采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。用顯微鏡觀察各腦片cfos陽性神經(jīng)元的標(biāo)記,細(xì)胞核呈棕黃色為 c-fos陽性細(xì)胞。以每個(gè)單位視野(200μm)內(nèi) c-fos陽性神經(jīng)元的數(shù)目來表示數(shù)量,具體判斷標(biāo)準(zhǔn)為 21～30個(gè)為 +++,11～20個(gè)為 ++,2～10個(gè)為 +,2個(gè)以下為 -,每組 6只取平均值。

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì) IBS大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能的影響

表1顯示,加味四逆散組與模型對(duì)照組結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或 P<0.05);得舒特組與模型組對(duì)照組比較,玻璃小球排除時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),排出糞點(diǎn)數(shù)有差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 藥物對(duì) IBS大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

表1 藥物對(duì) IBS大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

注:與模型組比較:P<0.05,P<0.01

組別 n 大鼠糞點(diǎn)數(shù) 玻璃小球排出時(shí)間(min)正 常 組 6 3.17±0.75 21.83±3.31模 型 對(duì) 照 組 6 4.50±0.55 15.33±1.86加味四逆散組 6 3.50±0.84 18.33±1.21得 舒 特 組 6 3.67±0.82 18.17±1.47

3.2 藥物對(duì) IBS大鼠小腸運(yùn)動(dòng)功能的影響

表2顯示,加味四逆散組與模型對(duì)照組小腸運(yùn)動(dòng)功比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),得舒特組與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3 大鼠腦區(qū)不同核團(tuán) c-fos蛋白表達(dá)檢測(cè)

表3顯示,正常組大鼠紋狀體偶見零星的 c-fos表達(dá),但染色較弱;模型對(duì)照組大鼠腦皮質(zhì)和紋狀體的 c-fos表達(dá)多,加味四逆散可明顯降低腦皮質(zhì)和紋狀體 c-fos陽性神經(jīng)元,減少 c-fos蛋白表達(dá)。

表2 藥物對(duì) IBS大鼠小腸運(yùn)動(dòng)功能的影響

表2 藥物對(duì) IBS大鼠小腸運(yùn)動(dòng)功能的影響

注:與模型組比較:P<0.05,P<0.01

組別 n 小腸墨汁推進(jìn)率(%)正 常 組 6 74.36±4.50模 型 對(duì) 照 組 6 87.44±5.41加 味 四 逆 散 組 6 75.31±5.62得 舒 特 組 6 78.75±5.56

表3 大鼠不同腦區(qū)核團(tuán)c-fos陽性神經(jīng)元的變化

表3 大鼠不同腦區(qū)核團(tuán)c-fos陽性神經(jīng)元的變化

組別 n 腦皮質(zhì) 紋狀體正 常 組 6 - ±模型對(duì)照組 6 ++++ +++加味四逆散組 6 ++ ++得 舒 特 組 6 ++ ++

4 討論

C-fos原癌基因的表達(dá)及作用強(qiáng)度可作為判斷神經(jīng)細(xì)胞損傷程度的一種分子生物學(xué)標(biāo)志。在正常情況下,c-fos在腦內(nèi)水平極低,難以測(cè)到,多種外界刺激可誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi) c-fos表達(dá)。目前中樞神經(jīng)在 IBS發(fā)病中的作用研究較多。已有研究證實(shí),疏肝理氣、調(diào)暢情志在整體上,可能與調(diào)節(jié)慢性心理應(yīng)激反應(yīng)與中樞多種神經(jīng)遞質(zhì)及其合成酶、神經(jīng)肽、激素、環(huán)核普酸系統(tǒng)以及 c-Fos蛋白的表達(dá)有關(guān),表現(xiàn)出多層次、多靶點(diǎn)及多環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn)。

本研究根據(jù) IBS病因病機(jī),選用由四逆散化裁而成的加味四逆散。四逆散源于張仲景的《傷寒論》,是疏肝和脾的基礎(chǔ)方,現(xiàn)代應(yīng)用十分廣泛,臨床多用于消化系統(tǒng)疾病和婦科疾病等,均取得較好療效。加味四逆散是由柴胡、白芍、枳實(shí)、炙甘草、炒白術(shù)等組成,柴胡解郁行氣、和暢氣機(jī)、透達(dá)郁陽;枳實(shí)行氣散結(jié);芍藥合營(yíng)益陰;炒白術(shù)健脾止瀉;炙甘草緩急和中,具有疏暢氣機(jī)、透達(dá)郁陽、健脾止瀉之功效。腸易激綜合征臨床多表現(xiàn)為肝脾不和,對(duì)于IBS肝郁脾虛的病機(jī)十分合拍。

我們采用束縛制動(dòng)加灌服番瀉葉的方法復(fù)制IBS動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn),造模期間大鼠毛色干枯無光澤,煩躁易怒,喜扎堆,大便多稀溏,甚則脫肛,符合中醫(yī)肝郁脾虛的診斷標(biāo)準(zhǔn),說明動(dòng)物模型制備成功。大鼠給予藥物治療后,毛色變得光澤,反應(yīng)靈敏,大便逐漸恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加味四逆散組大鼠玻璃小球排出的時(shí)間比模型對(duì)照組大鼠時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01),同時(shí)大鼠排的糞點(diǎn)數(shù)比模型對(duì)照組明顯減少(P<0.05),說明加味四逆散組大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能均有改善;加味四逆散組大鼠比模型對(duì)照組大鼠小腸墨汁的推進(jìn)率明顯減少(P<0.01),說明加味四逆散組大鼠的小腸運(yùn)動(dòng)功能亦有改善。通過慢性刺激方法,誘導(dǎo) c-fos在大鼠腦區(qū)不同核團(tuán)蛋白表達(dá),顯示加味四逆散能減少大鼠大腦皮質(zhì)和紋狀體 c-fos蛋白表達(dá)數(shù)目,說明加味四逆散方對(duì)腸易激綜合征大鼠腦腸軸有重要的調(diào)控作用。加味四逆散方通過何種途徑影響腸易激綜合征大鼠腦腸軸的調(diào)控機(jī)制,尚有待進(jìn)一步深入研究。