實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血腦內(nèi)Bax、Bcl2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

魏秀娥 榮良群

徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 徐州 221006

Qureshi等許多研究均證實(shí)［1－3］，細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了腦出血的繼發(fā)性損傷，是腦出血后血腫周?chē)鷧^(qū)細(xì)胞死亡的主要方式，Bcl－2基因家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Bcl－2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl－2基因家族中重要的凋亡促進(jìn)基因，其基因產(chǎn)物Bcl－2、Bax是重要的凋亡調(diào)控蛋白，Bax可通過(guò)其自身形成的Bax同二聚體和（或）與Bcl－2形成Bax－Bcl－2異二聚體而發(fā)揮作用。Bax同二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax－Bcl－2異二聚體則抑制細(xì)胞凋亡。Bax、Bcl－2是否在腦出血中表達(dá)及其特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道不一，因此，本實(shí)驗(yàn)擬利用自體血注入法建立大鼠ICH模型，對(duì)ICH凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl－2表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，以期在有效的時(shí)間窗內(nèi)爭(zhēng)取通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl－2和下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡，為臨床治療腦出血提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠84只，清潔級(jí)，成年雄性，體質(zhì)量220～250g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑：Bax Bcl－2 抗體（Santa Cruz Biotechnology，USA），二步法免疫組化檢測(cè)試劑（北京中山生物科技有限公司品），DAB顯色試劑盒（北京中山生物科技有限公司產(chǎn)品）。

1.1.3 主要儀器：動(dòng)物立體定位儀（江灣二型），100μL微量進(jìn)樣器（浙江省醫(yī)用器械廠），KD1508轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（日本），遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），電子分析天平（HR2140美國(guó)，精密度0.0001g）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備：參照Yang等［5］報(bào)道的方法改進(jìn)，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［4］確定尾狀核的位置：前囟前0.2 mm，矢狀縫向右3.0mm，深6.3mm為注射點(diǎn)。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350mg／kg）腹腔麻醉俯臥位固定于立體定位儀上，頭皮正中消毒后矢狀位切開(kāi)約1.5cm，暴露前囟點(diǎn)，據(jù)圖譜調(diào)整立體定位儀于注射點(diǎn)（A 0.2mm L 3.0mm V 6.3 mm），鉆顱打孔（直徑約1mm）將鼠尾置于40℃水溫浴10 min后取出擦干消毒，距離鼠尾末端3cm處剪斷，用100μL微量進(jìn)樣器吸取新鮮血液約50μL，迅速插入已鉆好孔內(nèi)，進(jìn)針6.3mm（相當(dāng)于尾狀核位置），注射時(shí)間不少于15min，留針10min緩慢退針，局部碘伏消毒后，縫合切口皮膚。大鼠清醒后無(wú)偏癱體征（Longa評(píng)分）者棄用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物給藥：正常組（Nor組）：不做任何處理，12只。生理鹽水組（NS組）：注入生理鹽水50μL，36只。出血組（ICH組）：立體定位后注入新鮮未凝血50μL，造模成功后3h原位固定后注入生理鹽水5μL，共36只。以上各組分別在6h、12h、24h、48h、72h、7d隨機(jī)處死大鼠各6只，用于免疫組化染色。

1.2.3 大鼠腦灌注固定及免疫組化染色：造模成功后大鼠分別于各時(shí)相點(diǎn)經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉后，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注37℃生理鹽水100mL，然后以250mL固定液（4℃0.01MPB PH 7.4 4%多聚甲醛）灌注固定腦組織，30min內(nèi)灌完，取全腦，去除小腦和腦干，置于上述固定液中后固定24 h，繼入20%、30%蔗糖液（4℃0.01MPB PH 7.4），直至組織塊沉底。將固定腦組織放在恒冷切片機(jī)上切取30μm厚的連續(xù)冠狀切片，于尾側(cè)向頭側(cè)隨機(jī)隔6片取一組鄰片，置于PBS中，進(jìn)行免疫組化染色。Bax、Bcl－2均采用漂染法，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.2.4 計(jì)數(shù)方法：免疫組化所有結(jié)果在10、20、40倍目鏡下觀察，采用40倍目鏡計(jì)數(shù)每張腦片4個(gè)視野，一只大鼠測(cè)兩張腦片，獲得8個(gè)數(shù)值取其均數(shù)為一只大鼠的最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 bcl－2表達(dá)：陽(yáng)性細(xì)胞染色均以胞漿有棕黃色物質(zhì)沉積為主，多見(jiàn)于血腫周?chē)坠?jié)區(qū)，并可顯示細(xì)胞輪廓；Nor組未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；NS組偶有表達(dá)，但各時(shí)相點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組各時(shí)相點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周?chē)鷅cl－2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

表1 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周?chē)鷅cl－2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

注：NS組各時(shí)相點(diǎn)均見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，組內(nèi)比較，＊P＞0.05；出血組同時(shí)相點(diǎn)與NS組比較，▲P＜0.01

6h 12h 24h 48h 72h 7d Nor組組別0 NS組 4.3±0.6＊ 4.4±0.7＊ 4.9±0.7＊ 5.1±0.8＊ 5.1±0.8＊ 5.0±0.7＊ICH組 6.2±0.9 11.0±1.2▲ 18.4±2.0▲ 30.4±2.9▲ 21.3±1.9▲ 16.9±1.7▲

2.1.2 bax表達(dá)：大鼠腦組織bax陽(yáng)性細(xì)胞在出血組織及血腫周?chē)斜磉_(dá)，細(xì)胞染色形式以胞漿有棕黃色物質(zhì)沉積為主，并可顯示出細(xì)胞輪廓，血腫組織中的陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)變化較大，胞體形態(tài)多不規(guī)則。NS組未見(jiàn)bax陽(yáng)性表達(dá)，而ICH組6h出現(xiàn)表達(dá)，12h表達(dá)明顯增加，1d達(dá)峰值，3d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，7d時(shí)仍持續(xù)存在，計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周?chē)鷅ax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

表2 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周?chē)鷅ax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

Nor組0 NS組 0 ICH 組 5.5±0.5 17.9±0.9 27.5±0.93 22.4±1.1 13.2±0.9 6.23±0.81

3 討論

既往研究表明，腦出血后腦損傷不僅是血腫的占位效應(yīng)和血腫對(duì)周?chē)X組織的直接破壞所致，腦出血后rCBF下降、灶周再灌注損傷、腦水腫形成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等均參與了腦出血繼發(fā)性損傷，近年來(lái)研究表明，作為一種基因調(diào)控的細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞凋亡參與了腦出血后神經(jīng)細(xì)胞損傷過(guò)程［6］，具體機(jī)制尚不清晰，分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞凋亡是機(jī)體在生長(zhǎng)、發(fā)育和受到外來(lái)刺激時(shí)清除多余、衰老和受損傷的細(xì)胞以保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制。bcl－2基因家族包含抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［7］。其中Bcl－2是重要的凋亡抑制基因，具有促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，位于凋亡基因網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵部位，阻止促凋亡信號(hào)的傳遞或其產(chǎn)物發(fā)揮作用；而bax是bcl－2基因家族中重要的凋亡促進(jìn)基因作用于細(xì)胞凋亡的晚期環(huán)節(jié)。正常情況下，Bax、Bcl－2在細(xì)胞中的表達(dá)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中，并受到機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控［8］。Bcl－2、Bax蛋白是重要的凋亡調(diào)控蛋白，Bax可通過(guò)其自身形成的Bax同二聚體和（或）與Bcl－2形成Bax－Bcl－2異二聚體而發(fā)揮作用。Bax同二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax－Bcl－2異二聚體則抑制細(xì)胞凋亡。既往研究認(rèn)為腦出血后早期凋亡相關(guān)蛋白以NF－κB等促凋亡蛋白增高為主，是臨床癥狀加重的可能因素，當(dāng)?shù)蛲鲆种频鞍譎SP70等表達(dá)增強(qiáng)時(shí)癥狀趨于穩(wěn)定［9］。本實(shí)驗(yàn)中Nor組與NS組右側(cè)基底節(jié)區(qū)均未見(jiàn)Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，ICH組特別是出血中心區(qū)損傷最重，神經(jīng)元變性較重，可見(jiàn)壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，亦未見(jiàn)Bax、Bcl－2表達(dá)。而血腫周?chē)鷧^(qū)Bax在出血后6h即出現(xiàn)表達(dá)，24h達(dá)到高峰，NS組即可見(jiàn)Bcl－2少量表達(dá)，ICH組Bcl－2在12h表達(dá)明顯，48h達(dá)高峰，術(shù)后7d二者陽(yáng)性表達(dá)仍持續(xù)存在。通過(guò)對(duì)腦出血大鼠血腫周?chē)鶥ax、Bcl－2蛋白動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了在腦出血的發(fā)生和演變中的確出現(xiàn)了Bax、Bcl－2蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)失衡。Bax促凋亡作用的機(jī)制可能［10］與Bax蛋白在線粒體膜上形成同源二聚體，產(chǎn)生離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，激活一系列酶，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡；而B(niǎo)cl－2在腦出血損傷過(guò)程中的作用機(jī)制與其具有抗氧化劑作用，可通過(guò)抑制超氧化物的產(chǎn)生和作用，從而抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)Bcl－2還可能通過(guò)抑制Ca2＋的釋放［11］，阻止促凋亡基因信號(hào)的傳遞，或阻止這些誘導(dǎo)基因產(chǎn)物如Bax、P53等［12］而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。出血24h后Bax蛋白表達(dá)達(dá)高峰，Bax－Bax同二聚體形成增加，促進(jìn)出血早期細(xì)胞凋亡的發(fā)生，之后Bax表達(dá)漸減少，且凋亡抑制蛋白Bcl－2表達(dá)漸增加，48h后達(dá)高峰，Bax－Bcl－2異二聚體形成增加，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使Bax／Bcl－2在分子水平達(dá)到新的動(dòng)態(tài)平衡，結(jié)果表明，凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl－2參與了出血后腦損傷，為臨床開(kāi)發(fā)治療腦出血的藥物提供新的思路。

［1］Qureshi AI，Suri MF，Ostrow PT，et al.Apoptosis as a form of cell death in intracerebral hemorrhage［J］.Neurosurgery，2003，52：1 041－1 047.

［2］Donovan FM，Pike CJ，Cotman CW，et al.Thrombin induces apoptosis in cultured neurons and astrocytes via a pathway requiring tyrosine kinase and RhoA activities［J］.J Neurosci，1997，17（14）：5 316－5 326.

［3］Matsushita K，Meng W，Wang X，et al.Evidence for apoptosis after intracerebral hemorrhage in rat striatum［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2000，20：396－404.

［4］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：35.

［5］Yang GY，Bets AL，Chenevert TL，et al.Experimental intrac－erebral hemorrhage：relationship between brain edema，blood flow，and blood－brain barrier permeability in rats［J］.J Neurosurg，1994，81（1）：93－102.

［6］Kazui S，Minematsu K，Yamamoto H，et al.Predisposing factors to enlargement of spontaneous intracerebral haematoma［J］.Stroke，1997，28：2 370－2 375.

［7］Ghobrial IM，Witzig TE，Adjei AA，et al.Targeting apoptosis pathways in cancer therapy［J］.CA Cancer J Clin，2005，55：178－194.

［8］Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochimica et Biophysica，2005，37（11）：719－727.

［9］Passero S，Rocchi R，Rossi S，et al.Seizures after spontaneous supratentorial intracerebral hemorrhage［J］.Epilepsia，2002，43：1 175－1 180.

［10］Krajewski S，Tanaka S，Takayame S，et al.Investigation of the subcellular distribution of bcl－2oncoprotein［J］.Cancer Res，1993，53：4 701.

［11］Li Y，Chopp M，Zhang ZG，et al.p53－immunoreactive protein and p53mRNA expression after trasient middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，1994，25：849.

［12］Mutch NJ，Robbie LA，Booth NA.Human thrombi contain an abundance of active thrombin［J］.Thromb Haemost，2000，86：1 028－1 034.