口服重組β2糖蛋白1的實驗性抗磷脂綜合征小鼠CD4+CD25+調節性T細胞及Foxp3mRNA表達變化①

付 嘉 方艷秋 司傳平 熊 斌 譚 巖 徐 立 （濟寧醫學院免疫教研室,濟寧 272013）

口服重組β2糖蛋白1的實驗性抗磷脂綜合征小鼠CD4+CD25+調節性T細胞及Foxp3mRNA表達變化①

付 嘉 方艷秋②③司傳平 熊 斌③④譚 巖②徐 立⑤（濟寧醫學院免疫教研室,濟寧 272013）

目的:觀察口服重組人β2糖蛋白1（rhβ2GP1）的實驗性抗磷脂綜合征（EAPS）小鼠CD4+CD25+調節性 T細胞（CD4+CD25+Treg）數量和功能變化,探討EAPS口服耐受機制。方法:以 rhβ2GP1主動免疫 BALB/c小鼠建立EAPS模型,口服耐受組在EAPS小鼠免疫10天前經胃腸道給予rhβ2GP1,在免疫12周后檢測各組小鼠抗β2糖蛋白1抗體（anti-β2-GP1）、抗心磷脂抗體（aCL）、流產率（%）、活化部分凝血活酶時間（aPTT）、血小板計數（PLT PBC）;以流式細胞術檢測各組小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg細胞百分率;RT-PCR檢測轉錄因子Foxp3mRNA的表達。結果:耐受組小鼠與模型組相比,anti-β2-GP1、aCL水平明顯降低,aPTT縮短,PLTPBC升高,流產率降低,均具有顯著性差異（P＜0.05）;耐受組小鼠PBMC中Foxp3m RNA表達在第4、8、12周均高于對照組（P＜0.05）,此后下降,20周時與正常對照組無明顯差異（P＞0.05）,4周時與模型組無差異（P＞0.05）,8周后模型組逐漸降低,12周后降低明顯（P＜0.05）;耐受組PBMC中CD4+CD25+Treg細胞百分率與對照組相比,未見顯著性差異（P＞0.05）。結論:CD4+CD25+Treg在口服耐受的誘導中發揮作用。

抗磷脂綜合征;口服耐受;CD4+CD25+調節性細胞;Foxp3

①本文受山東省自然科學基金項目（ZR2010CL017）、濟寧市科技局項目、濟寧醫學院重點科研項目、吉林省杰出青年基金（No.20050113）、吉林省科技廳國際合作項目（No.20060722）和吉林省科技廳基礎研究項目（No.200705101）資助

②吉林省人民醫院醫學診治實驗中心,長春130021

③通訊作者,E-mail:yq.fang@163.com;E-mail:xiongbin1116@yahoo.cn

④濟寧醫學院外科總論教研室,濟寧272013

⑤吉林大學第二醫院檢驗科,長春130021

CD4+CD25+調節性T細胞（CD4+CD25+regulatory T cell,Treg）是調節性T細胞中最為重要的一群,因其具有免疫調節和抑制作用,近年來受到研究者的密切關注。研究表明調節性T細胞對于維持機體免疫自穩、防止自身免疫病具有極其重要的作用,資料顯示CD4+CD25+Treg的數量減少或功能異常與多種自身免疫病相關[1-3]。

抗磷脂綜合征（Antiphospholipid syndrome,APS）是一種以動靜脈血栓形成,習慣性流產為特征的自身免疫病[4]。APS的確切病因目前還不很清楚,來自國內外研究顯示抗β2糖蛋白 1抗體（antiβ2GP1）、抗心磷脂抗體（ACA）、致炎因子生成,內皮細胞和血小板活化,凝血因子、補體及Toll樣受體的激活等機制參與APS的發病[5]。目前對APS的治療以大劑量的抗凝劑及免疫抑制劑為主要方法,長期使用會帶來明顯的副作用及危險性。故而有必要探索更為安全的治療方法[6]。

口服抗原或自身抗原誘導抗原特異性系統免疫低反應性的狀態稱為口服耐受。許多研究者將這種天然耐受途徑作為抑制實驗性自身免疫病及延長移植物存活的方法,也用于治療人類自身免疫病[1]。本課題組前期研究顯示:維持機體免疫自穩發揮重要作用的CD4+CD25+Treg參與EAPS的發病,且口服rhβ2GP1對 EAPS可有一定的緩解[7,8]。但對CD4+CD25+Treg是否參與EAPS口服耐受機制,國內外卻未見報道。

為進一步了解CD4+CD25+Treg在誘導EAPS口服耐受中所發揮的作用,本研究組擬將口服rhβ2GP1的EAPS小鼠與EAPS模型小鼠進行對比,采用流式細胞術檢測小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg細胞百分率及以RT-PCR檢測轉錄因子Foxp3mRNA的表達變化,以期為揭示EAPS口服耐受機制提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 流式細胞儀（BD公司）,抗小鼠 PE-anti-CD4、FITC-anti-CD25及同型對照 γ1/γ2（BD公司）;低溫高速離心機（Beckman）;CO2培養箱（GBB16 Heraus）;TRIZOL、Taq DNA 聚合酶;dNTP、MML-V逆轉錄酶等（晶美生物公司）;PCR引物（上海生工生物公司）;小鼠抗人β2-GP1單克隆抗體（鼎國生物公司）;辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG（北京中山生物技術公司）;CFA（Sigma）;心磷脂標準品（Sigma）、β2-GP1標準品（Advtech）。

1.2 實驗動物 BALB/c小鼠,雌性,8～10周,購于吉林大學基礎醫學院實驗動物中心,無特定病原菌（Specific pathogen free,SPF）條件下飼養。

1.3 方法

1.3.1 人β2糖蛋白1的重組表達 見文獻[9]。

1.3.2 實驗分組 將小鼠分為3組:口服耐受組、EAPS模型組及正常對照組。在EAPS模型建立前10天,三組小鼠用18號不銹鋼灌胃器分別以0.5 mg rhβ2GP1（前期研究顯示為合適時間及劑量）[7]/PBS/PBS灌胃,隔天灌胃1次,共5次。最后1次灌胃2天后開始給動物免疫。

1.3.3 rhβ2-GP1免疫方案 將20μg rhβ2-GP1與等體積的CFA混合至乳化后,足掌皮下注射模型及口服耐受組BALB/c小鼠,3周后采用等量rhβ2-GP1（溶于PBS）加強注射一次,正常對照組采用同樣方法以PBS/CFA免疫。免疫10周后將各組雌性小鼠與雄性小鼠合籠,次日上午檢查陰道栓是否形成,出現陰道栓的視為懷孕第一天,在懷孕第 15天（12周）檢測 anti-β2GP1、aCL活化、部分凝血活酶時間（aPTT）、血小板計數（PLT PBC）,并計算流產率（%）。

1.3.4 anti-β2-GP1、aCL的檢測 采用固相 ELISA檢測[10]。

1.3.5 流產率（%）的計算 流產率（%）=流產胚胎個數/（流產胚胎個數+未流產胚胎個數）。

1.3.6 aPTT的檢測 按照試劑盒說明書進行。

1.3.7 PLTPBC 應用血細胞自動分析儀計數血小板。

1.3.8 外周血CD4+CD25+Treg細胞的檢測 無菌取各組小鼠尾靜脈血,肝素抗凝。取100μl全血,分別加入抗CD4、抗 CD25抗體各10μl,另設對照管,加入同型陰性對照γ1/γ2,室溫孵育20～30分鐘,加入紅細胞裂解液,振蕩混勻,室溫孵育10分鐘。以2ml PBS 1 000 r/m in離心洗滌5分鐘,棄上清,將細胞懸浮于0.5ml PBS洗滌液中,振蕩混勻后上機檢測淋巴細胞亞群及CD4+CD25+Treg細胞亞群水平。

1.3.9 PBMC中Foxp3mRNA表達的檢測

1.3.9.1 引物設計 Foxp3引物P1:5′-CTGGATGAGAAAGGCAAGG-3′和 P2:5′-AAAGTGGATACGGTGGG AA-3′;GAPDH 引物 P3:5′-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3′和 P4:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.3.9.2 Foxp3mRNA表達的檢測 用Trizol試劑提取小鼠PBMC總mRNA,在42℃將1mg RNA逆轉錄。PCR反應體系中加入2.5mmol/L dNTPs,2.5 U Taq DNA多聚酶,0.25μmol/L引物。反應在PCR儀中進行,94℃變性45秒,55℃退火60秒,72℃延伸60秒。擴增前94℃變性90秒,之后72℃延伸 7分鐘,共進行32個循環。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀對條帶進行分析。電泳條帶以Foxp3的灰度值與GAPDH的灰度值的比值表示Foxp3mRNA的相對表達水平。

2 結果

2.1 各組小鼠的免疫反應及表現 如表1所示,模型組小鼠與正常對照組相比,anti-β2-GP1、aCL滴度升高,流產率升高,PLTPBC降低,aPTT延長,差異具有顯著性（P＜0.05）;而口服耐受組小鼠與模型組相比較,anti-β2-GP1、aCL水平明顯降低,aPTT縮短,PLTPBC升高,流產率降低,差異具有顯著性（P＜0.05）,其中流產率和aPTT與正常對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 小鼠PBMC中CD4+CD25+T細胞百分率變化分別在免疫后4、8、12、16、20周流式檢測三組小鼠的CD4+CD25+T細胞在CD4+T細胞中的百分率,結果發現,耐受組在各時間段與正常對照組相比,未見顯著性差異（P＞0.05）。模型組4、8周與對照組無明顯差異（P＞0.05）,12周后開始逐漸下降（P＜0.05）。對照組及耐受組在不同時間段比較未見顯著性差異（P＞0.05,圖1）。

2.3 小鼠PBMC中轉錄因子Foxp3mRNA表達變化

免疫后4、8、12 、16、20 周三組小鼠 Foxp3mRNA 表達變化如圖2,模型組小鼠第4周表達水平短暫升高,與耐受組無差異（P＞0.05）;第8周表達有所下降,12周以后mRNA表達水平下降明顯（P＜0.05）;耐受組小鼠PBMC中Foxp3mRNA表達在4周、8周、12周時明顯高于模型組（P＜0.05）,12周后下降,20周與正常對照組相比無明顯差異（P＞0.05）;對照組在不同時間比較差異無顯著性（P＞0.05）。

圖1 流式細胞術檢測口服耐受、模型及對照組小鼠PBMC中CD4+CD25+T細胞百分率變化Fig.1 Dynam ic study of percentage of CD4+CD25+T cells from PBMC in oral tolerized/model/control group m iceby FACS

圖2 RT-PCR檢測口服耐受、模型及對照組小鼠PBMC中Foxp3 mRNA表達的動態變化Fig.2 Dynam ic study of Foxp3mRNA expression from PBMC in oral tolerized/model/control group m iceby RT-PCR

表1 口服耐受組及模型組小鼠的臨床表現Tab.1 Clinicalmanifestations in oral tolerance group and model group

3 討論

口服耐受作為一種外周免疫耐受方式,在維持腸道免疫穩定及抑制病理性免疫應答中發揮重要作用[11]。利用此原理口服特異抗原誘導特異性免疫耐受,具有獨特的安全、特異的優點,為特異性治療自身免疫性疾病、食物過敏、腫瘤、移植等疾病提供了新的思路和途徑。故而吸引研究者重視和關注。口服耐受的機制有主動抑制、免疫無能和缺失、旁路抑制等。哪種方式在口服耐受中起支配作用在很大程度上取決于口服抗原的劑量。高劑量誘發T細胞的克隆清除,而低劑量主要是口服抗原在腸道誘導了抗原特異性的調節性T細胞（Treg）,對該抗原的系統免疫反應發生主動抑制。可能參與口服耐受的Treg包括CD4+CD25+CD8+Treg、Th3以及Tr1[12]。

CD4+CD25+Treg是調節性T細胞中最為重要的一群,因其在維持機體免疫自穩,防止自身免疫病具有極其重要的作用,近年來受到研究者的密切關注。CD4+CD25+Treg是一種組成性表達白細胞介素2（IL-2）受體α鏈（CD25）的CD4+T細胞,約占人和小鼠外周血CD4+T細胞的5%～10%,該細胞亞群主要在胸腺中分化、成熟,主要來源于 CD4+CD25-胸腺細胞,在CD4+T細胞的自然選擇過程中生成。其表面分子除高表達CD25外,還表達CD127-、CD45RBlow、CD5 、CD44、ICAM-1、LFA-1、部分CD62Lhigh及neuropilin-1等表面分子[13]。一系列研究發現,叉狀頭/翅狀螺旋轉錄因子Foxp3（forkhead/winged helix transcription factor）對CD4+CD25+Treg細胞在胸腺內發育和功能維持是必需的。CD4+CD25+Treg細胞具有免疫無能和免疫抑制兩大特性。對于CD4+CD25+Treg的免疫調節作用機制,現在普遍認為CD4+CD25+Treg通過與細胞接觸發揮抑制作用。體外研究表明,細胞因子IL-10、TGF-β1和細胞相關分子CTLA-4、GITR在CD4+CD25+Treg功能的發揮中起了一定的作用[14]。CD4+CD25+Treg對機體維持自身免疫耐受非常重要,其數量減少或功能缺失均可導致自身免疫性疾病的發生[1-3]。近年來,CD4+CD25+Treg已成為自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫等領域的研究熱點。本研究組的前期工作顯示,CD4+CD25+Treg在EAPS的發病機制中發揮重要作用,且口服rhβ2GP1對EAPS可有一定的緩解[7,8]。

本研究表明,在免疫第4周,自身反應性T、B淋巴細胞增殖活化的時期,模型組Foxp3mRNA表達短暫高于對照組（P＜0.05）,可能是機體適應性的代償反應[15]。隨著疾病進展不斷下降,到12周以后低于對照組（P＜0.05）。模型組CD4+CD25+Treg細胞亞群百分率在4至8周基本維持正常（P＞0.05）,在此時期 CD4+CD25+Treg細胞與效應性CD4+T細胞可暫時保持平衡,機體對自身組織的耐受并未破壞。此后逐漸下降,均明顯低于對照組（P＜0.05）,推測隨著疾病的進展,自身免疫反應產生的大量致炎因子如TNF-α、IL-6等可抑制CD4+CD25+Treg的功能,故而隨著疾病進展CD4+CD25+Treg細胞也相應的下降,以致效應性CD4+T細胞不斷增殖,導致APS的發生,這與模型組的癥狀開始出現的時間基本一致[16,17]。口服耐受組在免疫第4、8、12周Foxp3 mRNA表達均高于對照組,提示此時期Foxp3mRNA表達活躍,與自身反應性T、B淋巴細胞增殖活化相適應,維持機體免疫平衡,抑制EAPS發生。在第12周后略降低,第20周接近對照組,隨著自身反應性T、B淋巴細胞增殖活化的下降,Foxp3 mRNA表達出現適應性變化,有所下降。耐受組小鼠外周血CD4+CD25+T細胞百分率在各時間段并未出現與Foxp3mRNA表達升高相適應的變化,推測可因分化發育生成的CD4+CD25+T細胞向外周血及病變部位遷移而在體內重新分布,維持機體免疫自身穩定,故而并未見外周血中細胞百分率明顯變化[18]。同時與正常對照組相比,未見顯著性差異（P＞0.05）,提示口服rhβ2GP1對在免疫造模的過程中機體免疫平衡的破壞具有明顯地糾正作用,在EAPS疾病進展中免疫耐受并未被打破。可見CD4+CD25+Treg不但參與EAPS的發病機制,而且在口服耐受的誘導中發揮重要作用。

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[收稿2010-09-10 修回2010-10-27]

（編輯 倪 鵬）

Changesof CD4+CD25+regulatory T cells and Foxp3 mRNA expression in m ice with experimentalanti-phospholipid syndrome fed w ith recombinant humanβ2-glycoprotein 1

FUJia,FANGYan-Qiu,SIChuan-Ping,XIONGBin,TANYan,XULi.DepartmentofImmunology,JiningMedical College,Jining272013,China

Objective:To observe thequantitative and functional changes of CD4+CD25+regulatory T cells（CD4+CD25+Treg）in experimental anti-phospholipid syndrome（EAPS）mice fed with recombinant human β2-glycoprotein 1（rhβ2-GP1）.Methods:EAPSmodelwas established by immunizing BALB/cmicewith rhβ2-GP1.In tolerized groups,EAPSmicewere fedwith rhβ2-GP1 10 daysbefore immunization.Anti-β2-glycop rotein 1（anti-β2GPI）,anticardiolipin（aCL）titers in the sera,rate of the fetal resorptions,activated partial thromboplastin time（aPTT）and platelet countswere assayed after12 weeks.Percentage of CD4+CD25+Treg in peripheral blood mononuclear cells in mice from each groupswere determ ined by flow cytometry,the expressions levels of Foxp3 mRNA were detected by RT-PCR.Results:In tolerizedm ice anti-β2GPIand aCL Abs decreased significantly（P＜0.05）,resorption percentage decreased（P＜0.05）,aPTT shortened（P＜0.05）,and p latelet counts elevated（P＜0.05）.The expressing levels of Foxp3mRNA in the tolerized groupwere higher than those of control group（P＜0.05）on the fourth,eighth,twelfth weeks after immunization（P＜0.05）,but they began to decrease after twelfth week and therewere no significant differences on twentieth weeks between tolerized groups and control group（P＞0.05）.Theexpressing levels of Foxp3mRNA in the tolerized group were paralleled tomodelgroup on fouthweek（P＞0.05）and the latterbegan to decrease aftereighth week andwere lower than thoseof control group significantly after twelfthweek（P＜0.05）.The percentageof CD4+CD25+Treg cells from PBMC in tolerized group were paralleled to those of controlgroup during oral tolerance induction（P＞0.05）.Conclusion:CD4+CD25+Treg cells play roles in the induction of oral tolerance in EAPS.

Anti-phospholipid syndrome;Oral tolerance;CD4+CD25+Treg;Foxp3

R392

A

1000-484X（2011）12-1073-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.004

付 嘉（1973年-）,女,博士,主要從事免疫學、分子生物學方面的研究,E-mail:fujia730511@yahoo.com.cn。