骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過程中細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白作用的研究進(jìn)展

解 芳 滕 利

·綜述·

骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過程中細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白作用的研究進(jìn)展

解 芳 滕 利

目前，在骨組織工程研究中，各種細(xì)胞因子被廣泛應(yīng)用于促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）的增殖、分化以及誘導(dǎo)中。細(xì)胞因子的家族成員種類繁多，各自的功能也較復(fù)雜，而且彼此之間還存在著協(xié)同或拮抗的作用。如何更好地應(yīng)用這些誘導(dǎo)物質(zhì)，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，本文就該問題綜述如下。

1 概述

在細(xì)胞的增殖和分化過程中，有一系列的蛋白質(zhì)起著關(guān)鍵作用。其中，一些是細(xì)胞自身分泌的（自分泌），另一些是通過鄰近細(xì)胞分泌的（旁分泌），這些蛋白質(zhì)稱為細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子。組織工程研究中常用的生長(zhǎng)因子包括骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMP)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblastic growth factors，F(xiàn)GFs）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transformating growth factor-β，TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factor，IGF）等。它們能夠影響B(tài)MSCs的增殖、分化，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖，并合成細(xì)胞外基質(zhì)，最終促進(jìn)骨的生成。目前，通過對(duì)生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的研究，揭示BMSCs分化成骨的分子機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探討應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的可能和途徑，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

2 生長(zhǎng)因子

2.1 骨形成蛋白

BMP已成為骨組織工程研究中最重要的生長(zhǎng)因子之一，尤其是其中的BMP-2和BMP-7[1]。

有實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)人BMSCs用重組人BMP-2（rhBMP-2）作用96 h后，不僅細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）值明顯升高，細(xì)胞量也明顯增多，與rhBMP-2濃度呈正相關(guān)。說明rhBMP-2對(duì)人BMSCs的增殖與成骨分化具有促進(jìn)作用。Lecanda等[2]的研究證實(shí)，rhBMP-2能夠提高人BMSCs及肋骨來源的成骨細(xì)胞內(nèi)的ALP、骨鈣素、Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)，但同時(shí)導(dǎo)致這兩種細(xì)胞的增殖受到抑制。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，BMP-2具有促進(jìn)BMSCs增殖的作用。陳富林等[3]觀察了rh-BMP-2對(duì)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，結(jié)果表明，低濃度的rhBMP-2（＜0.16 mg/L）對(duì)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞的ALP活性、蛋白質(zhì)含量均有明顯的促進(jìn)作用，且呈劑量依賴性；而高濃度的rhBMP-2（＞0.16 mg/L）對(duì)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞的增殖有一定促進(jìn)作用，這證實(shí)了BMP不僅促進(jìn)骨髓細(xì)胞向成骨細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，而且可促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖。

有多項(xiàng)研究表明，rhBMP-2能明顯提高BMSCs在骨組織缺損中的修復(fù)能力，被認(rèn)為是骨缺損修復(fù)中生長(zhǎng)因子應(yīng)用的良好選擇[4-7]。部分學(xué)者認(rèn)為，BMP可以促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但不能使其向成熟成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]。BMP在促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的同時(shí)，還可抑制其向其他細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等的分化。

BMP-6、BMP-7在體內(nèi)外均有誘導(dǎo)骨源性干細(xì)胞分化的作用。轉(zhuǎn)染BMP-7基因的BMSCs不僅可促進(jìn)其自身向成骨細(xì)胞的定向分化，同時(shí)也能促使未轉(zhuǎn)染的BMSCs的定向分化，最終獲得干細(xì)胞來源的成骨細(xì)胞，滿足組織工程研究中對(duì)種子細(xì)胞的要求[1]。Adeno-BMP7轉(zhuǎn)染可促進(jìn)BMSCs的體外成骨定向分化，轉(zhuǎn)染后的BMSCs具有更強(qiáng)的體內(nèi)成骨能力，可明顯促進(jìn)新骨的形成，與未轉(zhuǎn)染的BMSCs相比，兩者有顯著差異[9]。

2.2 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）

bFGF是一種25 kD的多肽，包括至少19個(gè)密切相關(guān)的單肽。bFGF對(duì)BMSCs具有極強(qiáng)的促增殖作用。bFGF不僅能提高BMSCs的增殖速度和壽命，而且能在增殖過程中保留BMSCs的多向分化潛能。bFGF還被證實(shí)具有促進(jìn)血管生成的作用，可在骨組織工程中促進(jìn)血管向植入物中生長(zhǎng)，以利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)[1]。

有些學(xué)者認(rèn)為，bFGF能夠促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖，但對(duì)其分化成熟具有抑制作用。bFGF對(duì)成骨細(xì)胞分化作用不大，甚至可以阻止成骨細(xì)胞的分化。有研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能有效促使未成熟的間質(zhì)細(xì)胞分裂，如前軟骨細(xì)胞、前成骨細(xì)胞，而對(duì)成熟的分化較好的成骨細(xì)胞作用較弱，甚至有研究認(rèn)為它對(duì)分化好的成骨、軟骨細(xì)胞有抑制作用，并抑制骨基質(zhì)，如Ⅰ型膠原的合成[10]。但體內(nèi)研究認(rèn)為，bFGF能促進(jìn)骨折愈合，防止骨不連[11]。

研究表明，bFGF和rhBMP聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)人BMSCs的增殖和ALP活性的表達(dá)均有顯著作用，其效應(yīng)顯著大于單一因子的作用[12]。但外源性bFGF、rhBMP-2、TGF-β等，由于半衰期短，需反復(fù)大劑量使用，且價(jià)格昂貴。因此，目前多采用基因轉(zhuǎn)染方法促進(jìn)人BMSCs表達(dá)生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)增殖、分化；或使用多種因子聯(lián)合應(yīng)用的序貫治療，在序貫治療時(shí)常先使用促進(jìn)增殖的細(xì)胞因子，然后再使用促進(jìn)礦化的生長(zhǎng)因子。

2.3 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β

TGF-β是一族具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的生長(zhǎng)因子，對(duì)多種細(xì)胞具有促分化效應(yīng)，是作用較強(qiáng)的促成骨分化的因子，能提高ALP的表達(dá)，并能減少和延遲BMSCs向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而提高BMSCs的成骨效應(yīng)[1]。TGF-β可以顯著提高軟骨細(xì)胞表型，促進(jìn)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表達(dá)多種類型的膠原和蛋白多糖[13]。TGF-β1被認(rèn)為是促進(jìn)MSCs形成軟骨的必要條件，沒有TGF-β1的情況下只產(chǎn)生很少量的葡萄糖胺聚糖。在體外培養(yǎng)狀態(tài)下，TGF-β對(duì)乳鼠成骨細(xì)胞的作用是雙向的。在低劑量下，在細(xì)胞密度達(dá)到近于匯合或高密度培養(yǎng)時(shí)，TGF-β明顯地促進(jìn)DNA合成，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；而當(dāng)濃度高于15 ng/mL時(shí)，或細(xì)胞在低密度培養(yǎng)時(shí)，則使成骨細(xì)胞的DNA合成受到抑制。在無血清培養(yǎng)條件下，TGF-β促使BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

TGF-β、BMP-2可刺激體外培養(yǎng)的骨祖細(xì)胞增殖，TGF-β作用強(qiáng)于BMP-2，尤其是對(duì)早期的骨祖細(xì)胞。TGF-β對(duì)BMSCs的作用與細(xì)胞分化程度有關(guān)，早期可促進(jìn)增殖，晚期則促進(jìn)分化，但是TGF-β在體內(nèi)無骨誘導(dǎo)作用[14]。

2.4 胰島素樣生長(zhǎng)因子

IGF是一種半生長(zhǎng)激素依賴性多肽，是骨組織中含量最為豐富的生長(zhǎng)因子，能夠刺激骨細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂和分化，增加功能成熟的成骨細(xì)胞的數(shù)量和蛋白合成，在骨生成過程中,骨基質(zhì)內(nèi)IGF濃度明顯增高[1]。

Thomas等[15]對(duì)具有雙向分化潛能的hMS（3-4）的研究發(fā)現(xiàn)，IGF（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）能使細(xì)胞的增殖率增加2倍，但不改變CBFal、PPARZ（成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控因子）、ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素以及脂肪細(xì)胞系標(biāo)志物脂蛋白脂肪酶Adipsin的表達(dá)；IGF明顯刺激Ⅰ型膠原在分化后的hMS（3-4）細(xì)胞及成熟成骨細(xì)胞中表達(dá)，增加分化脂肪細(xì)胞中脂滴的含量。這說明，IGFs對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分化與細(xì)胞所處的分化階段有關(guān)。

2.5 在各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中培養(yǎng)BMSCs

周江等[16]的研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液提取液中含有多種生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，與成骨誘導(dǎo)液效果相同。另外，孫源等[17]以BMSCs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞（EC），使其能增強(qiáng)BMSCs的成骨活性，提高BMSCs的增殖能力。

骨細(xì)胞的培養(yǎng)液亦可用來促進(jìn)BMSCs的成骨分化。Heino等[18]從骨細(xì)胞MLO-Y4的培養(yǎng)液中提取條件培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液能促進(jìn)BMSCs的增殖和向成骨細(xì)胞分化。Matsubara等[19]用從牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞中提取的類細(xì)胞外基質(zhì)的基膜（b-ECM）上培養(yǎng)人BMSCs，結(jié)果顯示其生長(zhǎng)率、增殖期和多向分化潛能均較只用塑料培養(yǎng)瓶者增加，而且在第5代時(shí)其骨唾液蛋白和鈣沉積的水平仍與第2代相當(dāng)。Mauney等[20]用變性的Ⅰ型膠原基質(zhì)培養(yǎng)BMSCs獲得類似的結(jié)果，細(xì)胞傳至11代時(shí)，鈣沉積、堿性磷酸酶活性、骨唾液蛋白和堿性磷酸酶表達(dá)與第1代相比仍維持在69%～95%之間，而且還保留了某些常規(guī)培養(yǎng)條件下喪失的功能，如熱休克蛋白70的表達(dá)等。

2.6 骨生長(zhǎng)蛋白（OGP）

骨生長(zhǎng)蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一種促骨形成因子，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它能刺激骨形成，增加小梁骨的密度。體外實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)骨生長(zhǎng)蛋白促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，但對(duì)其增殖作用則因種屬而異。Robinson等[21]的實(shí)驗(yàn)表明，OGP可明顯刺激兔和人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的ALP活性及礦化結(jié)節(jié)形成，但抑制兔BMSCs的增殖，促進(jìn)人BMSCs的增殖。

2.7 瘦素（Leptin）

研究表明，瘦素能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化。瘦素可使人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞系hMS2-12的礦化能力增強(qiáng)，礦化基質(zhì)增加59%，成骨細(xì)胞ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯增加；同時(shí)向脂肪細(xì)胞的分化減弱，脂肪細(xì)胞基因Adipsin和Leptin的mRNA表達(dá)下調(diào)，脂滴形成減少50%。但未發(fā)現(xiàn)Leptin對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖率有影響[22]。

2.8 甲狀旁腺激素（PTH）

甲狀旁腺激素對(duì)骨轉(zhuǎn)化具有雙向調(diào)節(jié)作用；大劑量給藥時(shí)有促進(jìn)骨吸收的作用；小劑量時(shí)則能促進(jìn)成骨前體細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，發(fā)揮促進(jìn)骨形成的作用[1]。Kuznetsov等[23]研究表明，PTHrP是骨髓間充質(zhì)組織生長(zhǎng)和骨骼干細(xì)胞隔間的主要調(diào)節(jié)因子。持續(xù)應(yīng)用PTH將促進(jìn)骨吸收、導(dǎo)致骨丟失，間斷性小劑量應(yīng)用PTH則促進(jìn)骨形成、使骨量增加。Isogai等[24]將PTH作用于小鼠頭蓋骨成骨樣細(xì)胞，低密度接種時(shí)，ALP活性呈劑量依賴性增高；而高密度接種則抑制了ALP活性及骨鈣素表達(dá)。說明PTH對(duì)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化與細(xì)胞接種密度及分化階段有關(guān)。

2.9 雌激素和孕激素

雌激素可有效預(yù)防婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生，E2和抗骨質(zhì)疏松藥物XW630可刺激成骨細(xì)胞的增殖活性[25]。17β-雌二醇可調(diào)節(jié)BMSCs向成骨細(xì)胞分化而減少其向脂肪細(xì)胞分化,并且可以抑制成骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的橫向分化[26]。Delhon等[27]研究表明，雌激素相關(guān)受體α參與了成骨分化過程，它的沉默可以促進(jìn)成骨分化和鈣沉積。

Shuanhu等[28]的研究，揭示了雌激素作用于雌激素受體α和雌激素受體b在BMSCs向成骨分化過程中發(fā)揮的作用不同，作用于前者時(shí)發(fā)揮正性的作用，而作用于后者時(shí)呈現(xiàn)負(fù)性作用。

孕激素對(duì)BMCSs有誘導(dǎo)作用，可增加細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，刺激骨鈣素的分泌，但其作用主要針對(duì)培養(yǎng)早期的BMCSs，因而其作用目前尚存在爭(zhēng)議。

3 展望

在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中，多種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)起著重要的作用，目前的研究主要還集中在單一細(xì)胞因子的作用，對(duì)多種細(xì)胞因子的協(xié)同作用尚無定論，對(duì)于外源性細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)作用的時(shí)間階段和途徑還需進(jìn)一步探討。相信隨著BMSCs成骨分化的分子機(jī)制的深入研究，必將對(duì)臨床應(yīng)用和研究產(chǎn)生重要的指導(dǎo)意義，推動(dòng)骨組織工程的進(jìn)一步發(fā)展。

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R786，Q813.1+1

B

1673－0364（2010）01－0049－03

2009年11月19日；

2009年12月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.015

衛(wèi)生部臨床學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng)目（3030426-04）。

100144北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院。