反向遺傳學在植物研究中的應用

撰文/閆曉丹*

1、反向遺傳學及其技術介紹

反向遺傳學（reverse genetics）是相對于正向（經典）遺傳學而提出的。經典遺傳學的系統研究是從孟德爾的豌豆花實驗開始的，就是通過研究生物的表型、性狀來推測其遺傳物質組成、分布與傳遞規律等，從而研究生命過程的發生與發展規律的。即正向遺傳學主要研究生物突變性狀的遺傳行為，如控制突變性狀的基因數目及其在染色體上的位置以及突變性狀在后代中的傳遞規律等。反向遺傳學則是在已知基因序列的基礎上，利用現代生物理論與技術，通過核苷酸序列的突變、缺失、插入等手段創造突變體并研究突變所造成的表型效應。即反向遺傳學是直接從生物的遺傳物質入手來研究基因的生物學功能，闡述生物生命發生的本質現象與規律，如生物的繁殖復制機制、病毒的致病機制等。

而與反向遺傳學操作相關的各種技術統稱為反向遺傳學技術（r e v e r s e g e n e t i c s approach），包括RNA 干擾（RNA interference ,RNAi）技術、基因沉默技術、基因體外轉錄技術等，是DNA 重組技術應用范圍的擴展與延伸。隨著基因組序列測定技術的日漸成熟，反向遺傳學技術的應用將越來越廣泛。目前反向遺傳學技術已廣泛應用于生命科學研究的各個領域，且在病毒研究方面已經顯示出了巨大的作用，尤其是RNA 病毒的研究方面。

2、反向遺傳學的應用

2.1 用于拯救病毒或創造新型病毒 根據一些病毒的有關的已知核酸序列，采用反向遺傳學操作技術可以構建出“人為設計”的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列為基因組的新型病毒，這給獲得高免疫原性的低致病力毒株來制造疫苗提供了一個全新的途徑。也可在生產疫苗時，將流行毒株與高產毒株進行基因重配，得到同時具有高產特性和流行毒株抗原性的重組毒株，以提高疫苗產量。此外，由病毒的cDNA體外轉錄來獲得拯救病毒是研究RNA 病毒致病機制的有效手段。最早人們利用體外連接的方法將小片段的反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）產物連接起來，構建成病毒基因組全長的cDNA，并以此為模板進行體外轉錄，然后轉染易感細胞以獲得感染性的拯救病毒。近年來長鏈RT-PCR 技術發展迅速，使一次性擴增出病毒基因組全長的cDNA，并直接以擴增產物為模板來獲得拯救病毒成為可能。

2.2 用于負股RNA病毒的研究 反向遺傳學技術通過構建含有特定序列的感染性RNA病毒，在DNA 分子水平上對RNA 病毒感染性克隆進行體外操作，從而研究這些病毒特定蛋白的結構和功能、病毒各成分之間及病毒與細胞間相互作用、病毒致病機制、構建病毒載體及活疫苗的生產等。該技術最先是在正鏈RNA病毒上得到成功使用的。目前，已經獲得了脊髓灰質炎病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、煙草花葉病毒、登革病毒等的感染性分子克隆，且小RNA 病毒、黃病毒、甲病毒等正鏈RNA 病毒作為載體表達異源病毒蛋白的嘗試也取得了重大進展。

2.3 反向遺傳學研究的重要方法RNA干擾技術的應用 生物的每個組織、細胞所攜帶的遺傳信息是完全一致的，然而其形狀、功能和蛋白質組成等具有明顯不同，這都是由基因表達調控的時空性所導致的。基因表達的調控有轉錄前調控（即調控靶基因DNA）和轉錄后調控（即調控靶基因mRNA）兩種途徑。內源性雙鏈RNA干擾（double-strand RNA interference, dsRNAi）技術和反義RNA技術是調控靶基因mRNA的重要方式。RNAi是生物細胞內普遍存在的對抗病毒基因、轉座子或人工轉入基因所表達的mRNA 等外源基因的侵害，調控自身基因表達以防范疾病的一種自我保護現象，其提供了一種特異性失活功能基因的方法。它是指當與內源性mRNA編碼區某段序列同源的雙鏈RNA導入細胞后，使該mRNA發生特異性的降解，導致其基因表達的沉默，即轉錄后基因沉默。

RNAi 技術是反向遺傳學研究的重要手段，其在抗病毒、穩定轉座子和參與胚胎發育等方面具有重要的生物學功能。在功能基因組的研究中，需要對特定基因進行功能喪失或降低的突變以確定其功能。由于RNAi 具有高度的序列專一性，可以特異的使特定基因沉默，從而獲得功能喪失或降低的突變。因此，RNAi 可作為功能基因組研究的強有力的手段。與目前基因治療中常用的方法如反義RNA技術或轉入沒有功能的突變體相比，RNAi對基因表達的抑制具有高效、特異、簡便易行的特點。因此，RNAi 在人類功能基因組研究和疾病治療上也有很大的應用潛力。在植物中，RNAi 不僅作為一種防御機制，而且在植物發育過程中，通過使DNA甲基化或使染色質結構改變等參與內源基因的表達調控。

2.4 用于基因方面的研究 反向遺傳技術在病毒、動物、植物等基因研究方面具有重大應用價值,并取得了較大進展。一部分用于研究高等動植物相關基因功能:一些高等動、植物（如人類、水稻和Arabidopsis）測序完成后,最具有挑戰性的工作就是確定所有基因序列的生物學功能,通過基因突變、刪除等,利用反向遺傳學方法來研究未知基因的功能已受到研究者的廣泛關注。也可用該方法研究致使植物雜交不育與雜交失活相關基因的功能,是物種形成的遺傳學研究的良好工具。另一部分用于基因的克隆測序與定位:用反向遺傳學途徑克隆新基因是依據被克隆基因在染色體上的位置來實現,以圖位克隆與轉座子標簽技術為常見。隨著現代生物信息學的發展,出現了更為便捷的電子克隆（silicon cloning）方法。還可以用于研究動、植物細胞內DNA 的同源重組,基因序列分析，可在DNA的分子水平上構建嵌合病毒以研究病毒基因組的基因功能。此外,反向遺傳技術也被用于研究蛋白質與核酸之間的相互作用關系等方面。

3、反向遺傳學應用中存在的問題

反向遺傳學技術是隨著分子生物學技術尤其是DNA 重組技術的發展而建立起來的一門技術,在各科學研究領域里具有廣闊的應用潛力。隨著對生物分子水平的認識與了解, 以及人類和其他生物基因組測序、分析的完成,直接從遺傳物質著手來研究解釋生命本質與現象將變得越來越便捷、省時,在利用反向遺傳學技術為人類健康、生存服務的同時,也應加以高度的警惕,避免構造出對社會和人類健康造成威脅的病毒株或生物。目前，反向遺傳學在植物中的應用還不十分廣泛，因此，反向遺傳學在植物中如何應用，對于植物育種學家而言即是機遇也是挑戰。