現代動物細胞培養反應器概述

王洪躍，戴曉云

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現代動物細胞培養反應器概述

王洪躍，戴曉云

430060 武漢生物制品研究所（王洪躍）；200122 上海，瑞士比歐公司（戴曉云）

動物細胞在很多方面是不同于原核細胞和真菌的，例如較低的生長率、較高的剪切敏感性以及較低的氣泡耐受性，這些特性會對動物細胞生物反應器的設計產生一定的影響。特別是攪拌與通氣系統的構造需要滿足細胞生長于盡可能優化的罐內環境中。只有實現均質攪拌，才可避免出現溫度、pH、基質和產品濃度梯度的情況；同時，產生的減切力必須小于細胞的最高耐受。典型的機械攪拌是通過低速螺旋槳葉輪來實現的。氣升式反應器中的氣動攪拌，抑或流化床反應器中帶外置泵的水力攪拌，也是可以解決細胞培養所需的均質攪拌。為了避免由氣泡帶來的高泡沫和細胞損壞，可以通過減慢氣體流速、表面通氣或過膜無泡通氣來實現。但是如果減慢了氣體流速，就必須增大氣流中的氧濃度。氧氣、氮氣、空氣和二氧化碳的最佳供應量可以通過氣體流量計進行精確調節。

動物細胞培養可以通過有或無細胞截留的批次、流加和連續培養方式進行。批次培養的特征在于接種后的細胞增長是沒有額外培養基的添加。而培養基的限制或有毒代謝物的形成會降低生產率。而我們現在經常用到的流加技術，在接種之后，培養基或其他重要混合物被連續或逐步加入，乳酸鹽和銨鹽等生長抑制代謝物通過連續技術被轉移或稀釋，進一步解決了這些問題。但是由于動物細胞的低生長率和低生產率而導致的生產限制，使得帶有細胞截留（灌流系統）的連續培養工藝大受歡迎。現在我們主要通過適當的過濾系統，例如轉子過濾器或螺旋過濾器來實現細胞截留。很多哺乳動物細胞只能附于表面生長。這些貼壁細胞依附于微載體，微載體的材料可以是：玻璃、纖維素、葡聚糖、膠原蛋白、動物膠或塑膠。有些微載體被設計成中空的球體，細胞可以滲入至顆粒內部進行生長，從而免受剪應力的作用，從而可以提高攪拌速度和通氣量。

現有的動物細胞生物反應器種類很多，根據攪拌、通氣、滅菌及細胞截留的不同主要有如下幾種類型：

1 傳統攪拌式細胞反應器

傳統攪拌式細胞反應器是一種攪拌釜反應器，專門應用于動物細胞培養，工作體積可以從幾百毫升到幾十立方米。使用螺旋槳葉輪和傳統通氣來實現盡可能小的剪切力。

傳統攪拌式細胞反應器可以進行批次、連續及流加操作。反應器主要用于懸浮動物細胞培養或微載體培養。連續培養中，為截留細胞和提高產能，可以使用轉子和螺旋過濾器。而且它的內置式取樣裝置可確保傳染性細胞的無菌取樣，特別適用于病毒疫苗的生產。通過安裝不同的通氣系統，例如底部氣體分布器、表面通氣或硅膠管的無泡通氣，可以滿足不同細胞的培養需求。

2 氣升式動物細胞反應器

氣升式動物細胞反應器的攪拌是通過氣流來實現的，從而提供更加有效的氧傳遞和低剪切力。為了控制液體循環，可在中心處插入一個導向泡沫群的同軸通氣管。通過穿孔管、燒結體或疏水管實現氣體的分布。如果必須避免由氣泡導致的細胞損害，可通過硅膠管實現無泡通氣，適用于包括昆蟲細胞在內的懸浮細胞的培養。從試驗室規模至大生產規模，該類反應器均可適用。可批次、流加和連續操作。

3 流化床動物細胞反應器

流化床動物細胞反應器是一種將載體與懸浮固定化細胞結合在一起的生物反應器。通常涉及三個相（固態、液態和氣態）。為了細胞的連續生長和生產，它采用一種構造特殊的分離系統。它由不同的腔室組成，并確保灌注過程中顆粒的完整保留。它通過通氣攪拌，因而剪切力低，并能確保顆粒均勻渦流。氣泡敏感細胞可以通過硅膠膜實現無泡通氣。通過這種反應器可以獲取高密度的 CHO、BHK 和雜交瘤細胞。流化床動物細胞反應器推薦應用于微載體貼壁細胞、剪切敏感細胞、包被細胞以及需長期細胞培養的分泌物的生產。在流化床動物細胞反應器中，為了方便氣泡敏感細胞的培養，可使用纖維加固的硅膠管所構成的無泡通氣系統，用以避免流向中氧梯度的情況。

4 固定床動物細胞反應器

細胞和載體被固定于一個固定床中時，可選擇固定床反應器進行貼壁細胞培養。該系統無需特殊的氣、固、液分離裝置，由氣泡產生的剪切力和細胞損傷是很微弱的。培養期間，富氧培養基在固定床內循環。因為氧氣和培養基的供應是不確定的變量，所以對于軸流式固定床而言，床的長度是一個關鍵性的參數，在大型固定床動物細胞反應器中使用徑向流灌注有助于解決這一問題。它可連續或分批收獲濃縮產品和去除廢棄培養基。可用此類反應器進行貼壁細胞和剪切敏感細胞的培養。該系統同樣適用于產品是分泌性的長期細胞的培養。

5 薄膜動物細胞反應器

薄膜動物細胞反應器包含一個內腔室和一個外腔室，它們被一層透析膜隔開。這層薄膜支持灌注培養中的無泡通氣和細胞保留。運用了膜技術后，有毒的（低分子）代謝物被清除，（高分子）產物被保存在內腔室中。每個腔體內的攪拌是由一個攪拌器來進行的。培養基和空氣進入外腔室。反應器適用于灌注工藝，同時也可用于批次、流加工藝。可以使用此類反應器進行懸浮細胞和附于微載體的貼壁細胞的培養。

6 結語

介紹完了主要的幾種動物細胞反應器，有必要提一下細胞反應器中的重要組件，即用于細胞截留及提高產率的灌注過濾系統，它主要有兩種實現方式：

⑴轉子過濾器：轉子過濾器是以旋轉篩技術為基礎的。

可直接將其安裝于生物反應器的罐內或單獨作為一個外置旁路系統。內置的好處是系統結構緊湊；外置的優點是靈活性高，因為在培養期內可以將其單獨拆卸、清洗、滅菌并再次使用。該裝置可以保證在大規模連續培養中實現極佳的細胞截留率（≥ 80%）。

⑵螺旋過濾器：螺旋過濾器是以膜分離技術為基礎的。它著眼于高通量和低能耗的實現。一個旁路系統將螺旋過濾器與生物反應器相連接，可在位滅菌或高壓鍋內滅菌。因為剪切力很小，所以非常適用于細胞截留和無細胞取樣。

現代動物細胞反應器的發展日新月異，它的不斷發展源于生物制藥產業的新工藝、新材料、新檢測手段、新質控要求、新成本要求、新自動化控制策略等的大力推動。基礎扎實才能不斷推陳出新，希望我國能在動物細胞反應器的硬件、軟件、工藝等多個方面打好基礎，在動物細胞反應器的研發、生產及應用方面走在世界的前列。

戴曉云，Email：xydai@bioengineering.com.cn

2010-01-20

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.017