光滑念珠菌的流行現狀與耐藥機制

沈銀忠, 張永信

2.復旦大學附屬華山醫院感染科。

既往人們認為光滑念珠菌是人體黏膜組織的非致病性的共生菌,只是偶爾引起機會感染。然而,隨著免疫抑制劑在臨床的廣泛使用,以及免疫缺陷人群的增多,尤其是艾滋病疫情的蔓延,光滑念珠菌在臨床的檢出率明顯增加,在某些地區光滑念珠菌已成為僅次于白念珠菌的第2位或第3位的常見念珠菌[1]。光滑念珠菌對常用抗真菌藥物的敏感性低,對三唑類藥物尤其是氟康唑的耐藥率高[2],由其引起感染的治療相對較為困難,其所致系統性感染的病死率高[3]。近年來光滑念珠菌已引起人們的關注和重視,光滑念珠菌的研究取得了一些進展,本文就光滑念珠菌的流行現狀與耐藥機制作一綜述。

一、光滑念珠菌的流行病學

近年來,白念珠菌在臨床的分離率有所下降,而非白念珠菌的分離率有所升高,其中,由光滑念珠菌引起的感染明顯增加。Trick等[4]研究表明自1993年開始光滑念珠菌就成為美國ICU念珠菌血癥的重要病原菌,調查顯示從1989—1999年,由白念珠菌引起的血流感染的發病率輕度下降,而由光滑念珠菌所致的血流感染輕度上升,光滑念珠菌是引起念珠菌血癥的第2位常見病原菌。從全球范圍來看,光滑念珠菌血癥約占血流感染的15%,在北美光滑念珠菌血癥占血流感染的22%,在拉丁美洲占4%～6%[5],光滑念珠菌也是醫院感染的重要病原真菌。

近年來,光滑念珠菌已成為口腔黏膜的重要病原真菌,既可以與白念珠菌一起引起混合感染,也可單獨引起口腔黏膜感染[6]。Masiá Canuto等[6]發現從艾滋病患者口腔病灶分離出的非白念珠菌中,光滑念珠菌最為多見,由光滑念珠菌引起的口腔感染占艾滋病患者口腔念珠菌感染的14%。

光滑念珠菌也是分離自尿液的第2位常見病原真菌,光滑念珠菌是引起尿路念珠菌感染的第2位病原真菌。光滑念珠菌是外陰陰道念珠菌病(VVC)的常見病原真菌。有研究顯示光滑念珠菌是引起VVC最常見的非白念珠菌,從VVC患者病灶部位分離的念珠菌中,光滑念珠菌占34.5%[7]。

光滑念珠菌在人群的定植率和感染率與人群的年齡有關。在嬰兒和兒童中光滑念珠菌定植和感染均極為少見,隨著年齡的增長,光滑念珠菌的定植率和感染率均明顯升高[8]。光滑念珠菌的流行狀況與地理位置、年齡、人群以及氟康唑的使用狀況等因素有關[9]。目前認為光滑念珠菌感染的危險因素包括 ：HIV 感染 、糖尿病 、長時間住院、手術、導尿 、靜脈留置導管以及先前使用過抗生素或氟康唑等。

與其他非白念珠菌相比,光滑念珠菌引起的感染的病死率最高,光滑念珠菌感染的病死率為40%～70%[10],腫瘤患者和骨髓移植患者發生的光滑念珠菌血癥的病死率分別高達50%和100%[1]。

二、光滑念珠菌的耐藥機制

(一)光滑念珠菌的耐藥性 光滑念珠菌引起人們關注的一個重要原因就是其對常用抗真菌藥物包括兩性霉素B的敏感性低。耐藥性已成為影響臨床治療光滑念珠菌感染療效的主要原因。

兩性霉素B對絕大多數侵襲性真菌感染具有良好的療效,然而,光滑念珠菌可對兩性霉素B產生繼發耐藥[11]。盡管氟胞嘧啶在體外對念珠菌有抗菌活性,但光滑念珠菌對氟胞嘧啶原發或繼發耐藥也較為多見[11]。

三唑類抗真菌藥物是目前臨床應用最多的抗真菌藥物,然而,光滑念珠菌對三唑類抗真菌藥物的MIC值偏高,可對三唑類藥物原發耐藥,也可出現繼發耐藥,臨床以繼發耐藥多見,光滑念珠菌對三唑類藥物存在交叉耐藥。研究表明光滑念珠菌在接觸氟康唑后能迅速產生耐藥性,在接受氟康唑治療過程中,20%菌株可出現耐藥[10]。光滑念珠菌對三唑類藥物的敏感性具有“雙峰”的特征,即一部分菌株可以對三唑類藥物表現為耐藥,而另一些菌株則可以表現為敏感[11]。近年來光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率呈上升趨勢[2],光滑念珠菌對三唑類藥物的耐藥率具有明顯的地區差異[12]。據報道,光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率在美國為7%～14%,在歐洲為3.7%～40%,在巴西為4.3%～5.7%。2001—2003年期間亞太地區光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率為10.6%。

(二)光滑念珠菌對三唑類藥物的耐藥機制 光滑念珠菌對三唑類藥物敏感性低的機制并不十分清楚。近年來,人們已就光滑念珠菌對三唑類藥物產生耐藥性的機制進行了研究并取得了一些進展。

1.真菌細胞內藥物外排增強：研究顯示耐氟康唑光滑念珠菌細胞內藥物濃度降低,與此同時能量依賴性藥物外排增加,因此,目前認為光滑念珠菌對三唑類藥物耐藥的機制之一就是藥物在真菌細胞內的積聚減少,而細胞內藥物濃度降低主要是由細胞內的藥物外排增強所致,后者與具有藥物外排功能的多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein,MRP)有關,與光滑念珠菌藥物外排有關的MRP是ATP結合轉運蛋白(ABC-transporters)[13]。與光滑念珠菌耐藥密切相關的 ATP結合轉運蛋白是Cdr1p和Cdr2p,分別由CDR1和CDR2編碼。研究表明光滑念珠菌對氟康唑耐藥性的形成與CDR1、CDR2基因的過度表達有關[14]。Posteraro等[15]發現氟康唑耐藥菌株CDR1和CDR2 mRNA的表達分別上調了12.4～483倍和3.9～70.6倍。Sanglard等[13]對分離自艾滋病的兩對在遺傳學上嚴格配對的光滑念珠菌的耐藥性進行研究后發現：2株氟康唑耐藥株CDR1 mRNA的表達量分別上調了5倍和8倍,在對耐藥菌株的CDR1作缺失突變之后,突變菌株則恢復對氟康唑敏感,且真菌細胞內氟康唑積聚也增多。作者認為CDR1表達上調進而引起Cdr1p的藥物外排能力增強是光滑念珠菌耐藥形成的主要機制。Miyazaki等[16]等發現耐藥株中CDR2表達上調而真菌細胞內氟康唑濃度降低,作者認為CDR2上調引起藥物外排增強是光滑念珠菌耐藥性形成的機制之一。Bennett等[17]發現耐藥光滑念珠菌CDR1及CDR2 mRNA的表達均上調,同時真菌細胞內氟康唑濃度降低,這提示光滑念珠菌可通過上調CDR1及CDR2的表達而使轉運蛋白的轉運能力增強,從而形成耐藥性。

CDR1和CDR2在耐藥形成中的作用大小不同。Sanglard等[13]對光滑念珠菌的耐藥機制進行研究時發現：耐藥株CDR1 mRNA的表達量明顯上調,而CDR2 mRNA的表達量變化不大,作者認為CDR1對光滑念珠菌的獲得性耐藥起決定作用,CDR2在耐藥性形成中的作用不及 CDR1。Shin等[18]研究發現光滑念珠菌氟康唑耐藥株CDR1和CDR2 mRNA的表達量分別比敏感株上調13.2倍和3.5倍,CDR1 mRNA的表達量上調幅度明顯高于 CDR2;Sanguinetti等[14]發現氟康唑耐藥株CDR1 mRNA的表達量明顯上調,而CDR2 mRNA的表達量僅輕度上調。由此可見,CDR1與光滑念珠菌耐藥性的關系更為密切,在耐藥形成中的作用更大。研究表明,CDR1與CDR2所編碼的轉運蛋白在氨基酸序列上有70%以上的同源性,所轉運的底物也大致相似,但Cdr1p的藥物外排能力更強,故在光滑念珠菌耐藥性形成中所發揮的作用較Cdr2p大[19]。

耐藥菌株CDR1和CDR2上調表達的調控機制尚不十分清楚。Vermitsky等[20]認為 CDR1與CDR2的表達是由一個共同的機制來進行調控的。研究表明CDR1與CDR2具有相同的轉錄調節因子。Tsai等[21]研究發現光滑念珠菌PDR1能調節ATP結合轉運蛋白編碼基因的表達,在光滑念珠菌耐藥性形成中發揮重要的作用,PDR1突變可引起PDR1 mRNA表達的上調,進而上調 CDR1的表達。

2.藥物作用靶酶發生改變：三唑類抗真菌藥物主要通過抑制真菌細胞膜麥角固醇合成通路上的細胞色素 P-450羊毛固醇14α-去甲基化酶(14-DM)的催化活性來發揮抗真菌的作用。14-DM由ERG11編碼,研究表明光滑念珠菌ERG11 mRNA的上調表達與光滑念珠菌耐藥有關[22]。Marichal等[22]發現耐藥光滑念珠菌ERG11 mRNA的表達量比敏感株增加了8倍。ERG11表達上調引起14-DM發生改變,三唑類藥物在光滑念珠菌細胞內必須有更高的藥物濃度才能發揮其阻斷靶酶合成的作用,藥物由于不能充分發揮其阻斷作用而形成耐藥性[11]。Niimi等[23]研究表明光滑念珠菌在接觸氟康唑后,可以迅速誘導光滑念珠菌膜蛋白14-DM的表達,14-DM從幾乎難以檢測到的水平變為細胞膜中的主要成分之一。Rogers等[24]發現耐藥菌株14-DM 的表達量高于敏感株。這些研究說明光滑念珠菌可通過上調ERG11 mRNA的表達,引起14-DM表達量增多而形成耐藥性。

光滑念珠菌ERG11突變是否與其耐藥性有關目前尚無定論。Sanguinetti等[14]發現光滑念珠菌氟康唑耐藥株ERG11存在多個同義突變,但未發現ERG11存在錯義突變。Brun等[25]對呼吸缺陷型光滑念珠菌(由線粒體DNA突變所致)耐藥機制進行研究時分析了ERG11的突變情況,共發現了6個點突變,每個點突變在親本株與耐藥株中均出現,且均為同義突變,作者同樣未發現ERG11存在錯義突變或移碼突變。盡管這些研究尚未發現因ERG11突變引起靶酶氨基酸改變而導致的光滑念珠菌對氟康唑耐藥,但這些研究所檢測的菌株數均有限,而ERG11突變是否影響ERG11的表達亦不清楚,因此,目前尚不能排除ERG11突變參與光滑念珠菌耐藥性形成的可能,ERG11突變在光滑念珠菌臨床分離株耐藥性形成中的作用仍需進一步研究。

3.線粒體功能的缺失：光滑念珠菌耐藥的另一機制是在氟康唑的作用下光滑念珠菌出現線粒體功能缺失[26]。線粒體功能缺失的突變株對氟康唑耐藥,但線粒體功能的缺失是可逆的,突變菌株能在線粒體功能缺失(氟康唑耐藥狀態)與功能正常(氟康唑敏感狀態)之間頻繁轉換,有些菌株體外藥敏試驗表現為對氟康唑敏感,但在氟康唑的作用下,光滑念珠菌在體內可以發生表型轉換,轉換為對氟康唑耐藥,因此,臨床上使用氟康唑治療仍無效[26]。呼吸缺陷型光滑念珠菌由于線粒體功能的缺失可出現對氟康唑耐藥[26],法國學者Brun等[25]對其耐藥機制進行研究后發現：突變體 CDR1表達明顯上調,CDR2表達僅輕度上調,而ERG11表達無變化,故認為CDR1上調表達是呼吸缺陷型光滑念珠菌耐藥形成的主要機制。

4.光滑念珠菌耐藥形成機制的多樣性和復雜性：目前的研究表明光滑念珠菌的耐藥性主要與ERG11、CDR1和CDR2有關,但是這些耐藥相關基因和機制均不能解釋臨床上所有的耐藥現象。Redding等[27]研究發現：分離自同一患者的2株耐氟康唑光滑念珠菌中,1株耐藥菌ERG11、CDR1和CDR2 mRNA的表達明顯上調,而另1耐藥株相應基因mRNA的表達卻正常。盡管目前認為ERG11表達上調與耐藥有關,但很多研究顯示耐藥光滑念珠菌ERG11表達并無上調[14,25]。由此可見,單個耐藥相關基因或單一耐藥機制均不能解釋光滑念珠菌全部的耐藥現象。目前認為光滑念珠菌耐藥性的形成是一個涉及多種機制的復雜過程,其耐藥性常是多種機制共同作用的結果[14,27]。隨著蛋白質組學的興起,人們通過蛋白質組研究發現了一些可能與光滑念珠菌耐藥性有關的蛋白質。Marichal等[22]對光滑念珠菌氟康唑耐藥株和敏感株進行蛋白質組分析后發現耐藥株中至少有25種蛋白質表達量增加和76種蛋白質表達量減少,作者認為這些差異表達蛋白質可能為耐藥相關蛋白質。Rogers等[24]發現實驗室誘導的光滑念珠菌氟康唑耐藥株中存在25個差異表達蛋白質,認為這些差異表達蛋白質均可能與耐藥形成有關。這些差異表達蛋白質的鑒定為發現新的耐藥基因和耐藥機制奠定了理論基礎。

(三)光滑念珠菌對多烯類抗真菌藥物的耐藥機制 麥角固醇合成旁路中相關酶的編碼基因發生突變導致真菌細胞膜中麥角固醇減少或缺乏是真菌對多烯類抗真菌藥物耐藥形成的重要機制[11]。Vandeputte等[28]研究發現：對兩性霉素B耐藥的光滑念珠菌的細胞膜中麥角固醇缺乏而麥角固醇合成過程中的一些中間產物則明顯增多。進一步檢測發現耐藥光滑念珠菌ERG6中存在點突變,引起所編碼的氨基酸發生改變,而催化一些中間產物合成的酶的編碼基因的mRNA的表達明顯上調。可見,ERG6突變可以導致光滑念珠菌對兩性霉素B耐藥。

三、結語

光滑念珠菌已成為臨床常見的念珠菌,由其所致的黏膜和系統性感染不斷增多。光滑念珠菌的流行狀況與地區、人群以及抗真菌藥物的使用情況等因素有關,應加強對光滑念珠菌流行病學的研究以進一步明確光滑念珠菌感染的危險因素、流行狀況和耐藥變化趨勢。光滑念珠菌對包括兩性霉素B在內的常用抗真菌藥物的敏感性低,由其所致感染的治療存在困難。光滑念珠菌 ERG11、CDR1和CDR2過度表達與其對三唑類藥物的耐藥性有關,ERG6突變與其對多烯類藥物的耐藥性有關,光滑念珠菌的耐藥性是多種機制共同作用的結果,其中許多機制仍有待進一步闡明。

[1] Li L,Redding S,Dongari-Bag tzoglou A.Candida glabrata,an emerging oral opportunistic pathogen[J].J Dent Res,2007,86(3)：204-215.

[2] Pfaller MA,Pappas PG,Wingard JR.Invasive fungal pathogens：current epidemiological trends[J].Clin Infect Dis,2006,43(Suppl 1)：S3-14.

[3] Bodey GP,M ardani M,Hanna HA,et al.The epidemiology of Candida glabrata and Candida albicans fungemia in immunocompromised patients with cancer[J].Am J Med,2002,112(5)：380-385.

[4] T rick WE,Fridkin SK,Edwards JR,et al.Secular trend of hospital-acquired candidemia among intensive care unit patients in the United States during 1989-1999[J].Clin Infect Dis,2002,35(5)：627-360.

[5] Pfaller M A,Messer SA,Boyken L,et al.Geog raphic variation in the susceptibilities of invasive isolates of Candida glabrata to seven sy stemically active antifungal agents：a global assessment from the ARTEMIS Antifungal Surveillance Program conducted in 2001 and 2002[J].J Clin Microbiol,2004,42(7)：3142-3146.

[6] Masiá Canuto M,Gutiérrez Rodero F,Ortiz de la Tabla Ducasse V,et al.Determinants for the development of oropharyngeal colonization or infection by fluconazole-resistant Candida strains in HIV-infected patients[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2000,19(8)：593-601.

[7] Ozcan SK,Budak F,Yucesoy G,et al.Prevalence,susceptibility profile and proteinase production of yeasts causing vulvovaginitis in Turkish women[J].APMIS,2006,114(2)：139-145.

[8] Hajjeh RA,Sofair AN,Harrison LH,et al.Incidence of bloodstream infections due to Candida species and in vitro susceptibilities of isolates collected from 1998 to 2000 in a population-based active surveillance program[J].J Clin Microbiol,2004,42(4)：1519-1527.

[9] Antoniadou A,To rres HA,Lewis RE,et al.Candidemia in a tertiary care cancer center：invitro susceptibility and its association with outcome of initial antifungal therapy[J].Medicine(Baltimore),2003,82(5)：309-321.

[10] Krcmery V,Barnesz AJ.Non-albicans Candida spp.causing fungaemia：pathogenicity and antifungal resistance[J].J Hosp Infect,2002,50(4)：243-260.

[11] Perea S,Patterson TF.Antifungal resistance in pathogenic fungi[J].Clin Infect Dis,2002,35(9)：1073-1080.

[12] Pfaller MA,Jones RN,Doern GV,et al.Bloodstream infections due to Candida species：SENT RY antimicrobial surveillance program in North America and Latin America,1997-1998[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(3)：747-751.

[13] Sanglard D,Ischer F,Calabrese D,et al.The ATP binding cassette transporter gene CgCDR1 from Candida glabrata is involved in the resistance of clinical isolates to azole antifungal agents[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(11)：2753-2765.

[14] Sanguinetti M,Posteraro B,Fiori B,et al.Mechanisms of azole resistance in clinical isolates of Candida glabrata collected during a hospital survey of antifungal resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2)：668-679.

[15] Posteraro B,Sanguinetti M,Fiori B,et al.Caspofungin activity against clinical isolates of azole cross-resistant Candida glabrata overexpressing efflux pump genes[J].J Antimicrob Chemother,2006,58(2)：458-461.

[16] Miyazaki H,Miyazaki Y,Geber A,et al.Fluconazole resistance associated with drug efflux and increased transcription of a drug transporter gene,PDH1,in Candida glabrata[J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42(7)：1695-1701.

[17] Bennett JE,Izumikawa K,Marr KA.Mechanism of increased fluconazole resistance in Candida glabrata during prophy laxis[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(5)：1773-1777.

[18] Shin JH,Chae MJ,Song JW,et al.Changes in karyotype and azole susceptibility of sequential bloodstream isolates from patients with Candida glabrata candidemia[J].J Clin Microbiol,2007,45(8)：2389-2391.

[19] Wada S,Tanabe K,Yamazaki A,et al.Phosphorylation of Candida glabrata A TP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and AT Pase stability[J].J Biol Chem,2005,280(1)：94-103.

[20] Vermitsky JP,Edlind T D.Azole resistance in Candida glabrata：coordinate upregulation of multidrug transporters and evidence for a Pdr1-Like transcription factor[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(10)：3773-3781.

[21] Tsai HF,Krol AA,Sarti KE,et al.Candidaglabrata PDR1,a transcriptional regulator of a pleiotropic drug resistance network,mediates azole resistance in clinical isolates and petite mutants[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(4)：1384-1392.

[22] Marichal P,Vanden Bossche H,Odds FC,et al.Molecular biological characterization of an azole-resistant Candida glabrata isolate[J].Antimicrob Agents Chemother,1997,41(10)：2229-2237.

[23] Niimi M,Nagai Y,Niimi K,et al.Identification of two proteins induced by exposure of the pathogenic fungus Candida glabrata to fluconazole[J].J Chromatogr B Analyt T echnol Biomed Life Sci,2002,782(1-2)：245-252.

[24] Rogers PD,Vermitsky JP,Edlind TD,et al.Proteomic analysis of experimentally induced azole resistance in Candida glabrata[J].J Antimicrob Chemother,2006,58(2)：434-438.

[25] Brun S,Bergè s T,Poupard P,et al.Mechanisms of azole resistance in petite mutants of Candida glabrata[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(5)：1788-1796.

[26] Kaur R,Castano I,Cormack BP.Functional genomic analysis of fluconazole susceptibility in the pathogenic yeast Candida glabrata：roles of calcium signaling and mitochondria[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(5)：1600-1613.

[27] Redding SW,Kirkpatrick WR,Saville S,et al.Multiple patterns of resistance to fluconazole in Candida glabrata isolates from a patient with orophary ngeal candidiasis receiving head and neck radiation[J].J Clin Microbiol,2003,41(2)：619-622.

[28] Vandeputte P,Tronchin G,Bergès T,et al.Reduced susceptibility to polyenes associated with a missense mutation in the ERG6 gene in a clinical isolate of Candida glabrata with pseudohyphal g rowth[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(3)：982-990.