活性氧在細菌耐抗生素機制中的作用

張亞妮，段康民

(西北大學生命科學學院，西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室，陜西西安710069)

活性氧在細菌耐抗生素機制中的作用

張亞妮，段康民

(西北大學生命科學學院，西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室，陜西西安710069)

細菌對抗生素的耐藥性以驚人的速度蔓延，闡明抗生素導致細菌死亡內在機制，對提高抗生素藥效以及尋找新型抗生素顯得尤為迫切。近期研究表明，抗生素引起的細菌內活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)產生，是導致細菌細胞死亡的關鍵原因。該文對ROS、SOS和細菌耐藥性方面的最新研究進行了綜述和探討，為開發新型抗菌藥物，遏制細菌感染和耐藥性提供新的思路。

抗生素;耐藥性;活性氧;SOS;損傷負荷;損傷修復

面對越來越多耐藥細菌的出現和抗生素資源漸漸枯竭的雙重危機，尋找新型抗生素，必須要轉移到在細菌的應激反應和防御系統中尋找切入點，這樣才能有望遏制細菌的耐藥性。細菌對抗生素產生耐藥性主要是由其遺傳物質的變化引起，包括遺傳物質轉移(質粒的接合、噬菌體轉導、水平基因的轉移)，潛在的可動遺傳因子(mobile genetic elements)激活(轉座子或隱蔽基因)，以及自身DNA的突變［1］。這些有可能是由于細菌染色體直接和抗生素之間相互作用的結果，也可能是由于抗生素引起的活性氧物質導致產生的，或者是細菌中的差錯修復系統在修復DNA損害時形成的［2］。以上方面可能是細菌改變和逃避抗生素抑殺的新機制，也是在治療細菌感染時一直忽略的方面。目前研究表明，細菌面對抗生素時生理應答引起的氧化壓力升高，ROS過量產生，是導致細菌遺傳物質變化的主要因素［3－4］。這種生理應答包括SOS DNA損傷應答［5－6］、熱休克蛋白應答［7］、氧化壓力應答［8－9］。本文中，我們將討論抗生素怎樣造成細菌內氧化壓力，以及ROS在細菌耐藥機制中的作用。

1 抗生素誘導細菌ROS的形成

越來越多的證據表明［10－11］，抗生素的存在可引起細菌內氧化壓力升高，ROS過量產生，是導致細菌細胞死亡的關鍵原因。ROS是生物體內與氧代謝有關的含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱，主要有超氧陰離子、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)、一氧化氮(NO)等。正常情況下，細胞內ROS的產生和清除是平衡的，隨著ROS的過量產生或受其它環境脅迫時，細胞中的氧化還原平衡即偏向氧化的一邊，此種不平衡的狀態就會形成氧化壓力(oxidative stress)［12］。ROS處于較不穩定的狀態，其反應活性較非自由基高，易與其它分子發生反應［13］。造成細胞膜脂質過氧化、蛋白質及DNA的傷害，其中以DNA的傷害最為嚴重。

為了證明細菌細胞的死亡與ROS直接相關，研究針對不同細菌細胞靶位的抗生素所帶來的影響。這些抗生素包括:氟喹諾酮類抗生素(作用靶位是拓撲異構酶)、氨基糖苷類抗生素(作用靶位是核糖體)、β-內酰胺類(作用靶位是肽聚糖合成)。當用革蘭陰性桿菌(大腸埃希菌)和革蘭陽性球菌(金黃色葡萄球菌)測試時，所有三類抗生素都誘導細菌細胞中產生·OH［9］。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種廣泛存在于生物體中一種非常重要防御氧化損傷的金屬酶，它在維持生物體內的產生與消除的動態平衡中起重要作用。SOD可催化發生歧化反應，從而清除但研究發現氟喹諾酮類藥物可以抑制大腸埃希菌中SodA和SodB酶活性，β-內酰胺類和氨基糖苷類抗生素可以抑制AhpC酶(氫過氧化物還原酶)活性［14］。因此，Dwyers等［2］認為殺菌抗生素誘導細菌死亡途徑中可能存在著一個由OH·介導的共同反應機制。

2 細菌的損傷修復

細菌可通過多種途徑對ROS引起的DNA損傷進行修復［15］。SOS應答是DNA受到損傷或復制受阻時的一種誘導反應，在大腸埃希菌中，這種反應由recA-lexA系統調控，正常情況下處于不活動狀態。當有誘導信號如DNA損傷或復制受阻形成暴露的單鏈時，recA蛋白的蛋白酶活力就會被激活，分解阻遏物lexA蛋白，使SOS反應有關的基因去阻遏而先后開放，產生一系列細胞效應。引起SOS反應的信號消除后，recA蛋白的蛋白酶活力喪失，lexA蛋白又重新發揮阻遏作用。SOS反應中易出錯多聚酶的表達是細菌發生突變并產生抗性的關鍵原因，認為只要關閉SOS系統，即阻止了過度進化，就能防止級聯突變的發生。正是這種級聯突變，使大腸埃希菌產生了對抗生素的耐藥性。環丙沙星會引起lexA蛋白的剪切，細菌的SOS應答，從而誘發細菌迅速產生耐藥性［16－17］。

在細菌細胞中DNA損傷并不總是被除去，當損傷負荷(lesion burden)超過細胞修復機制所能承受的能力或損傷本身不能被其修復途徑識別、修復時，一些DNA損傷會在基因組上暫時保留下來，而帶有大量未修復損傷的細胞照樣能進行DNA復制及分裂，這就是DNA的跨損傷合成(translesionsynthesis，TLS)，通常又被稱為損傷旁路(damage bypass)，正是這種跨損傷合成系統的存在使DNA復制受阻恢復，細胞周期繼續，細胞耐受其DNA損傷，降低了細胞對各種DNA損傷因素包括電離輻射殺細胞效應的敏感性，其后果往往是使細胞更易于發生突變。

在大腸埃希菌中，損傷誘導的突變由SOS反應誘導產生的DNA聚合酶Ⅴ(polⅤ、umuC和umuD基因編碼)來完成［18，19］。在SSB、RecA存在下，polⅤ的跨損傷合成能力增強，導致SOS定標性突變(SOS targeted mutagenesis)。當復制未損傷的DNA時，polⅤ也表現出高突變性并且易形成嘌呤或嘌呤、嘧啶或嘧啶錯配，導致SOS非定標性突變(SOS nontargeted mutagenesis)［20］。SOS反應還啟動dinB基因，編碼polⅣ，polⅣ缺少3'→5'外切酶活性，是低保真度聚合酶，缺乏3'→5'校讀外切核酸酶活性，能以嚴格分布方式(strictly distributive manner)和延伸鼓出的(bulged)引物/模板結構、錯配的引物/模板能形成滑移中間體(slipped intermediate)［20］。最近的研究結果［19，21－22］發現polⅣ可能是細菌在各種代謝應激條件下引發全基因組范圍突變的主要候選酶。

3 ROS引起的細菌遺傳物質突變

當細菌處于極端逆境下時，它們會嘗試各種方式，將受到的損傷作為突變的初始步驟。然后，它們開啟一些基因，這些基因表達的蛋白會加速突變的發生，這類突變的產生速度，比細胞復制期間產生突變的速度要快1萬倍。實質上，這些細胞經受了一種迅速的身份轉變。例如，大腸埃希桿菌通過發出SOS，對環丙沙星和其他抗生素造成的持久性DNA損傷作出應答。發生的突變阻止環丙沙星結合其靶標——促旋酶，因為促旋酶是DNA復制所必需的。如果細菌不能阻止環丙沙星與促旋酶結合，那么細菌的DNA就不能正常復制，以致斷裂，接著細菌就會死亡。

DNA氧化損傷產物主要有8-氧-脫氧鳥苷(8-oxodG)和2-羥基腺苷(2-OH-A)，其中8-xodG穩定，是最重要的產物。在細菌體內，8-oxodG引起DNA損傷的機制可以使模板鏈中鳥嘌呤(G)的直接氧化，也可以使核苷酸池中游離鳥苷氧化，DNA聚合酶與8-oxodG:A的結合效率不比正常的G:C配對效率差，因此，如果8-oxodG:C不能得到及時修復，在復制中8-xodG易與A錯配，導致G:C→A:T的堿基顛換，從而引起相關基因功能的改變［23］。目前認為，堿基切除修復系統(base excision repair，BER)在抗氧化損傷中發揮主要作用，可將氧化的核苷酸前體物或堿基移除，明顯降低8-oxodG的致突變作用，使錯誤堿基不至于結合進入DNA的復制產物中，進而提高基因的穩定性［24］。在細菌體內，BER修復酶基因主要有3種:MutT、MutM、MutY。MutT是1個核苷三磷酸解酶，將氧化的鳥嘌呤腺苷三磷酸(8-oxodGTP)降解為氧化的鳥嘌呤腺苷單磷酸(8-oxodGMP)，這樣單磷酸的核苷酸即無法在復制時進入基因中，避免因氧化的堿基而造成錯配的發生［25－26］。MutM則是利用它的糖基化酶活性(glycosylase)，從8-oxodG:C的配對中移除8-oxodG，并利用AP裂解酶活性(AP lyase)使DNA中的嘌呤堿基開環，進而形成AP位點，接著再行修復成為完整的G:C配對。當8-oxodG:C的累積超過MutM的修復時，則過多的8-oxodG:C會產生8-oxodG:A錯配。此時若不經修復，在DNA復制時將造成永久性的錯配，因此需另1種蛋白質參與修復，即MutY。MutY是一種腺嘌呤糖基酶(adenine glycosylase)，移除與8-oxodG: A堿基錯配中的腺嘌呤，而形成AP位點。當腺嘌呤移除后，MutY會確認8-oxodG與胞嘧啶形成8-oxodG:C配對后，使得MutM有第2次的機會可以修復移除氧化的堿基8-oxodG［27－28］。

4 總結

抗菌藥物為人類的健康生存和發展作出了巨大的貢獻，然而隨后出現的細菌耐藥性問題已經發展到了非常嚴重的地步，深入了解抗生素的作用機制及其相關的耐藥機制對研制新的有效的抗菌藥物是非常必需的。

將抗生素的耐藥性與因ROS引起的細菌對大分子破壞SOS反應、DNA易誤復制相關聯的數據正不斷增多，這些數據可用來開發新的抗菌藥物。在以前確定新抗生素新靶標的工作中，可能沒注意到這些反應中的網絡關系，因為它們對細胞生長一般是非必需的。通過抑制這個網絡途徑的化合物獲得研制抗生素新概念，同時對統治藥物開發的“一個化合物對一個靶標”的概念是一種重要的變通方法。盡管這種開發抗生素的方式面臨著各方面的挑戰，但應注意到，這可能是抑制細菌感染的另一有效策略。

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Role of reactive oxygen species in mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria

ZHANG Ya-ni，DUAN Kang-min
(Key Laboratory for Biological Resources and Modern Biotechnology of West China，College of Life Sciences，Northwest University，Xi'an710069，China)

Antibiotic resistance has been spreading at an alarming rate among pathogens，which poses a great threat to human health．It is critical to investigate the mechanisms of action of antibiotics in order to develop new antibiotics and enhance the efficacy of the existing ones．Recent studies indicate bactericidal antibiotics kill pathogens via a common pathway involving reactive oxygen species(ROS)．In this review，the recent progress in the interplay of ROS，SOS and antibiotic resistance has been discussed．These data should prove to be of importance for the development of new antibiotic strategies and encountering with pathogen drug resistance．

antibiotic;drug resistance;reactive oxygen species;SOS;lesion burden;repair damage

R-05;R 378;R 978．1

A

1001－1978(2010)09－1129－03

2010－05－20，

2010－06－21

國家自然科學基金資助項目(No 30870097);2010年陜西省自然科學基金資助項目(No 2010JQ4023);2010年陜西省教育廳科學研究項目

張亞妮(1975－)，女，博士，研究方向:細菌的耐藥性，Tel: 029-88302411，E-mail:yani@nwu．edu．cn;段康民(1962－)，男，教授，博士生導師，研究方向:病源菌的致病性和新型抗生素研究，Tel:029-88305288，E-mail:kduan@nwu．edu．cn