組織和細胞中Ca2+濃度測定方法的研究進展

邊 原，肖洪濤，陳 璐

Ca2+在人體內不但具有重要的生理作用，在組織或細胞產生病理反應時其濃度還能反映病灶的病變程度，它作為細胞內的信息傳遞物質，具有調節細胞功能、參與信號跨膜傳遞以及介導細胞對外界刺激的應答反應等重要作用［1］。因此，組織或細胞內Ca2+濃度測定方法的研究和改進，對臨床和藥學相關實驗研究具有重要的意義［2］。

1 45Ca 跨膜流動測定方法

同位素45Ca(T0.5=163 d，β射線能量為0.25 MeV)與生物體中的Ca2+具有相同的生物活性，由于45Ca發出的β射線能被探測，因此只要測量45Ca進入細胞內的數量變化就可快速、直觀地反映出藥物對Ca2+通道的阻滯特性。平滑肌細胞膜上一般存在有3種Ca2+通道:① 靜流鈣通道;②受體鈣通道;③電壓依賴鈣通道。欲真實測量通過每一種鈣通道進入細胞中45Ca的量，必須除掉在細胞膜外面的全部45Ca。該法采用冷EGTA絡和法測量45Ca進人細胞的量，既能除去細胞外的45Ca2+，又能確保已進人細胞中的45Ca2+不重新流出細胞外。國內有研究者［3-4］將此方法用于動物組織包括心肌、主動脈等所含的Ca2+進行測定，效果較好，同時為中藥對鈣通道的影響提供了較好的方法，具有用樣少、操作簡便、快速靈敏、重現性好等優點。

2 X射線微區分析方法

X射線微區分析技術利用電子束轟擊樣品，產生特征X射線。特征X射線是入射電子激發外層電子釋放的，其能量和波長為每種離子所固有，通過這種特性就有可能進行元素定性分析，進行定量分析的基礎在于特征X射線的強度與樣品中所含元素的濃度有關。目前X射線微區分析技術能夠成功地用于測量細胞內肌漿網和內質網等細胞器所含的Ca2+濃度［5］。有研究發現細胞內內質網上的鈣庫具有非均勻性。研究者通過電刺激海馬神經元樹突發現一些內質網囊狀結構的Ca2+濃度出現非常強勁的增長，同時其它一些囊狀結構卻沒有應答反應［6］。目前此研究法在形態學識別細胞器內Ca2+濃度方面具有最高的分辨率。

3 離子選擇微電極方法

離子選擇性微電極(ISME)是一種能測定細胞等生物微環境內單一離子活度的信息傳感器，其主要特點是微型化，尖徑在1 μm內，能在不損傷細胞的情況下，直接插入單個細胞內，運用電位測定法測定細胞內的離子濃度。所以IMSE對研究細胞的生理功能十分重要，目前廣泛應用于生物醫學、臨床檢驗和藥物分析等。楊紅蕓等［7］利用自制Ca2+選擇性微電極建立血清樣品中Ca2+測定方法，研究結果表明Ca2+-ISME可用于內源性藥物鈣制劑的藥物代謝動力學研究。

4 核磁共振波譜方法

核磁共振(NMR)波譜方法是無損傷研究生物樣本的重要手段，能夠在接近生物樣本生理狀態下連續動態地進行檢測［8］。19FNMR是細胞內Ca2+測定的非光學方法，由于正常生物體內含氟成分少，為了得到足夠的響應，在檢測游離Ca2+濃度時使用含氟指示劑，目前常用的指示劑為nF-BAPTA［n fluoro-1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N′，N′tetraacetic acid］衍生物。nF-BAPTA需經過乙酰氧甲酯的化學修飾(nF-BAPTA-AM)才能進入細胞內，之后水解成為游離酸形式，與細胞內游離Ca2+結合形成螯合物Ca2+-nF-BAPTA。根據所形成的螯合物解離常數(Kd)不同，可分為快交換型5F-BAPTA和慢交換型4F-BAPTA。用核磁共振檢測快交換型的5F-BAPTA在NMR波譜圖上得到其結合和未結合Ca2+型2個峰，由兩峰的峰面積比和Kd，可計算細胞內游離Ca2+濃度;對于慢交換型的4F-BAPTA會出現單峰，利用結合與未結合Ca2+型的化學位移計算Ca2+濃度［9］。

5 原子吸收分光光度法測定方法

原子在一般情況下處于能量最低狀態(基態)。當原子吸收外界能量被激發時，其最外層電子可躍遷到較高的不同能級上(激發態)。處于激發態的電子很不穩定，一般在極短的時間便躍回基態，此時原子以電磁波的形式放出能量。原子吸收分光光度法是基于光源輻射出具有待測元素特征波長的光通過試樣原子蒸氣時，被蒸氣中待測元素的基態原子所吸收，然后利用光被吸收的程度來測定待測元素的含量。它具有測定靈敏度高、檢出限小、干擾少、操作簡單、快速等優點。毛亞倫等［10］利用原子吸收分光光度法、熒光指示劑法以及細胞膜酶活性法研究感染嚴重程度與紅細胞膜鈣泵、細胞內外Ca2+濃度關系，結果表明感染患者存在細胞外Ca2+向細胞內流動，導致細胞功能紊亂、損害甚至死亡。

6 熒光指示劑測定方法

熒光指示劑測定法是用具有特異性與細胞內游離鈣離子結合的熒光探針或染料，以其與鈣離子結合后熒光強度所發生改變通過成像、激光共聚焦顯微技術等測算細胞內Ca2+含量的一種方法，目前應用較為廣泛，常用于測定細胞內各種細胞器Ca2+含量。

6.1 線粒體中［Ca2+］的測量 目前線粒體中Ca2+濃度的測量最廣泛應用的熒光指示劑為Rhod-2。在乙酰氧甲酯的作用下，Rhod-2帶有的正電荷，可使該指示劑在線粒體中優先累積。經脫酯后指示劑散落在線粒體中，并且在線粒體囊腔中顯示 Ca2+濃度［11］。

Rizzuto等［12］首先成功的將生物發光蛋白-水母熒光素定位線粒體中的Ca2+。利用定位線粒體Ca2+的指示劑發現在血管壁內皮細胞內存在大量的Ca2+，并且線粒體Ca2+的濃度迅速發生變化定位線粒體外葉的水母熒光素顯示，在以肌醇三磷酸(IP3)介導的從內質網釋放的Ca2+過程中，線粒體比其它細胞器更易于接收到較高的Ca2+信號［13］。Montero等［14］使用與線粒體內Ca2+具有不同親合性的水母熒光素，并和不同類型的熒光素發光底物腔腸素重新組合，能夠擴大Ca2+濃度測定的線性范圍。近年來，科學家開始用人工熒光蛋白cameleon、pericam以及camgaroo等來進行Ca2+的濃度測量。此類研究方法以相應的cameleon為基礎表現出線粒體指示劑的定位以及對Ca2+的敏感程度。此外該研究還使用新型工藝，在內質網和線粒體內產生有關Ca2+循環的在概念方面的重要消息［15］。Rodolf等［16］在生理條件下用指示劑cameleon對骨骼肌中的Ca2+進行測量，此方法使用了雙光子顯微技術，解決了線粒體中Ca2+濃度迅速變化而測定不準的問題，并具有特異性。

6.2 內質網中［Ca2+］的測定 內質網是Ca2+釋放的重要細胞器，其所含的Ca2+已經成功的被所有類型的光學Ca2+探針(包含天然水母熒光素、人工熒光蛋白以及低分子量的熒光指示劑)在內質網的管腔內所捕捉到。Demaurex等［17］通過研究發現應用光學鈣離子探針能夠很成功的快速定位和固定內質網內的Ca2+。此法相比之前的探針方法有了很大的改進。cameleon蛋白的熒光共振能量轉移效率不會影響Ca2+的生理濃度。新型cameleon具有適合內質網Ca2+測量的Kd值以及具有合理的動態范圍。將鈣網硬蛋白信號序列以及內質網保留信號(KDEL)添加到cameleon Design 1(D1)中，從而形成以內質網 Ca2+為目標的 cameleon(D1ER)。Palmer等［18］指出 D1ER在內質網 Ca2+測量的敏感度方面提供了相當大的改善，要比以往的 cameleon YC4.3ER要優越。D1ER與Fura-2的完美結合，可以用來同步測量各種比例的細胞溶質和內質網所含的Ca2+。

Hofer等［19］最早使用低分子量鈣指示劑測定內質網所含Ca2+濃度。低分子量鈣指示劑Mag-Fura-2的乙酰甲氧酯在胞液和細胞內間隔中積累，隨后通過洋地黃或人參皂苷對Ca2+作用，使Ca2+經由質膜選擇性滲透釋放出來，隨后與指示劑作用通過熒光強度得出結果［20］。Park等［21］使用整體單元形狀貼片夾具方法用來除去細胞溶質的指示劑。此法可以在內質網的細胞腔中對Ca2+濃度的動態變化進行記錄并保存質膜的完整性。

20世紀90年代初，Kendall等［22］最早開始嘗試研究可用于內質網Ca2+測量的水母熒光素。由于水母熒光素親合性低，研究者嘗試不同類型的熒光素發光底物進行改進。使得該技術可以用于內質網鈣的測量。Demaurex等［23］通過方法改良以及半合成技術研究出人工水母發光蛋白嵌合體，能夠適合于在肌漿網細胞腔中對Ca2+進行測量。

6.3 內體(endosome)以及溶酶體中［Ca2+］的測量 Ca2+在內體以及溶酶體運輸過程中具有重要作用。Ca2+指示劑BAPTA可以快速與細胞溶質內的Ca2+進行螯合，從而可以抑制初級內體的融合作用。Pryor等［24］研究發現一些Ca2+指示劑還可以抑制次級內體與溶酶體酶的運輸小泡的融合作用。目前常使用低親合性鈣指示劑Oregon Green 488 BAPTA-5N測量內體中Ca2+的濃度，此指示劑在初級內體中具有一定程度的耐酸性［25］。研究發現初級內體的Ca2+濃度相對較低，Ca2+損失與細胞器酸化有密切關系。Christensen等［26］使用Fura-2右旋糖苷以及 Oregon Green BAPTA-1右旋糖酐指示劑測定Ca2+，發現來自內體的Ca2+的溢出可能參與細胞器早期的酸化作用。次級內體以及溶酶體的Ca2+濃度遠超過初級內體的Ca2+濃度。

進一步研究發現次級內體以及溶酶體的相對較高的Ca2+濃度需要細胞器內的蛋白具有一定的酸性pH值。加入擾亂溶酶體的酸性因子可以導致細胞器蛋白內Ca2+的急劇減少。這說明只要細胞器的酸性化程度充分，H+/Ca2+交換便可能積累相當數量的Ca2+并且可以作為細胞器的Ca2+信號源［27］。

6.4 細胞核內［Ca2+］的測量 Ca2+離子在細胞核的生命進程中具有重要調節作用，包括基因表達，DNA復制、蛋白的磷酸化作用，細胞周期和細胞凋亡的調節作用［28］。外部核膜與內質網膜極其相似，事實上它是內質網薄膜的延長部分。核膜的胞腔與內質網相連，而內部核膜的成分與外部的核膜不同。細胞核通過內質網型Ca2+-ATP酶積累Ca2+。核膜包含鈣結合蛋白鈣網硬蛋白以及鈣釋放渠道InsP3Rs、毒蔁堿受體、蘭尼堿受體等［29-30］。細胞核是一種很大的細胞器，可以通過熒光Ca2+敏感指示劑和共聚焦顯微技術與細胞質區分出來。目前低分子量指示劑廣泛用來測定Ca2+并比較細胞核與細胞質中Ca2+的信號差異［31］。

通過細胞核定位信號，將具有熒光性的Ca2+感應蛋白cameleon定位到細胞核中［32］。改良的 cameleon降低了對pH的敏感度，其鑲嵌于具有特異性的神經元表達序列被成功的引入到下丘腦部分神經元中，這一過程顯示Ca2+在細胞核和胞質調節方面存在著一定的差異［33］。Nagai等［34］使用pericam指示劑來監測Ca2+在人子宮頸癌傳代細胞的細胞核中的濃度變化，并且對線粒體初期Ca2+變化進行比較。pericam指示劑還用于與細胞質和線粒體指示劑相結合的心肌細胞中，該研究顯示了細胞區室中的同步Ca2+濃度震蕩過程［35］。

7 總結

通過對組織和細胞內Ca2+濃度的動態監測與準確測定，能更深入的認識許多生理和病理過程，對與Ca2+參與的相關藥物作用機制的研究有極其重要意義。Ca2+測定方法不同，同種方法所用的指示劑又不盡相同。但每種測定方法都有其獨特的優點，因此實驗前應根據個人的實驗目的仔細選擇正確、簡便、經濟的檢測方法，以及合理和現有的指示劑與信號檢測儀。通過嚴謹科學的實驗設計，以最終獲得成功的實驗結果。

［1］Marganski W A，Gangopadhyay S S，Je H D.Targeting of a novel Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡis essential for extracellular signal-regulated kinase-mediated signaling in differentiated smooth muscle cells［J］.Circ Res，2005，97(6):541-9.

［2］Celli A，Sanchez S，Behne M，et al.The epidermal Ca2+gradient:Measurement using the phasor representation of fluorescent lifetime imaging［J］.Biophys J，2010，98(5):911-21.

［3］盛艷梅，張 藝，張 靜，等.45Ca同位素技術用于燈盞細辛中抗鈣活性有效組分的研究［J］.中國藥理學通報，2005，21(4):507-8.

［3］Sheng Y M，Zhang Y，Zhang J，et al.Study on active components of Erigeron breviscapus with antagonistic effect by45Ca isotope technique［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(4):507-8.

［4］周青罡，李卉芳，莫尚武，等.復脈Ⅰ號對大鼠心肌和主動脈45Ca跨膜流動的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21(1):26-8.

［4］Zhou Q G，Li H F，Mo S W，et al.Effect of fumai I on45Ca transmembrane flow in rats cardiac muscle and aorta［J］.Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol，2010，21(1):26-8.

［5］Gemene K L，Bakker E.Measurement of total calcium by flash chronopotentiometry at polymer membrane ion-selective electrodes.Anal Chim Acta，2009，648(2):240-5.

［6］Alvania R S，Chen X，Ginty D D.Calcium signals control Wntdependent dendrite growth［J］.Neuron，2006，50(6):897-909.

［7］楊紅蕓，呂太平，江詠梅.鈣離子選擇性微電極在鈣制劑藥代動力學研究中的應用［J］.華西醫大學報，2001，32(4):609-11.

［7］Yang H Y，Lü T P，Jiang Y M.Application of Ca2+-ISME in the studies on pharmacokinetics of calcium supplements［J］.J W CUM S，2001，32(4):609-11.

［8］黃容清，喬 娟，肖炳坤，等.細胞內游離離子及離子通道的核磁共振研究［J］.分析測試學報，2005，24(2):119-22.

［8］Huang R Q，Qiao J，Xiao B K，et al.Study on the intracellular free ion and ion channel by nuclear magnetic resonance spectroscopy［J］.J Instr Anal，2005，24(2):119-22.

［9］劉 棟，常相娜，陳興娟，等.氟代指示劑在核磁共振測細胞內鈣離子中的應用［J］.化學工程師，2005，112(1):41-3.

［9］Liu D，Chang X N，Chen X J，et al.Application on fluorescent probe for determination of intracellular free calcium by NMR［J］.Chem Engin，2005，112(1):41-3.

［10］毛亞倫，劉東海.感染嚴重程度與紅細胞膜鈣泵、細胞內外鈣離子濃度關系的研究［J］.現代實用醫學，2001，13(9):442-4.

［10］Mao Y L，Liu D H.Relations of severity level of infection to erythrocyte membrane-Ca pump，concentration of intra-and extra-cellular calcium ion［J］.Mod Pract Med，2001，13(9):442-4.

［11］Camello-Almaraz C，Salido G M，Pariente J A，et al.Role of mitochondria in Ca2+oscillations and shape of Ca2+signals in pancreatic acinar cells［J］.Biochem Pharmacol，2002，63(2):283-92.

［12］Rizzuto R，Pinton P，Carrington W，et al.Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+re-sponses［J］.Science，1998，280(5730):1763-6.

［13］Csordas G，Hajnoczky G.Plasticity of mitochondrial calcium signaling［J］.Biol Chem，2003，278(43):42273-82.

［14］Montero M，Alonso M T，Carnicero E，et al.Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+transients that modulate secretion［J］.Nat Cell Biol，2000，2(2):57-61.

［15］Inouye S，Sasaki S.Blue fluorescent protein from the calcium-sensitive photoprotein aequorin:catalytic properties for the oxidation of coelenterazine as an oxygenase［J］.FEBS Lett，2006，580(8):1977-82.

［16］Rudolf R，Mongillo M，Magalhaes P J，Pozzan T.In vivo monitoring of Ca2+uptake into mitochondria of mouse skeletal muscle during contraction［J］.Cell Biol，2004，166(4):527-36.

［17］Demaurex N，Frieden M.Measurements of the free luminal ER Ca2+concentration with targeted“cameleon”fluorescent proteins［J］.Cell Calcium，2003，34(2):109-19.

［18］Palmer A E，Jin C，Reed J C，Tsien R Y.Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，102(50):17404-9.

［19］Hofer A M，Machen T E.Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1，4，5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2［J］.Proc Natl Acad Sci，1993，90(7):2598-602.

［20］田建明，鄭淑秋，葉金梅，等.人參皂苷Rg2對培養心肌細胞內游離Ca2+含量的影響［J］.中國藥理學通報，2003，19(11):1320.

［20］Tian J M，Zheng S Q，Ye J M，et al.Effect of Ginsenoside Rg2 on content of free Ca2+in cultural cardiac muscle cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(11):1320.

［21］Park M K，Tepikin A V，Petersen O H.What can we learn about cell signalling by combining optical imaging and patch clamp techniques［J］?Pflugers Archiv-Eur J Physiol，2002，444(3):305-16.

［22］Kendall J M，Salanewby G，Ghalaut V，et al.Engineering the Ca2+-activated photoprotein aequorin with reduced affinity for calcium［J］.Biochem Biophys Res Commun，1992，187(2):1091-7.

［23］Demaurex N，Frieden M.Measurements of the free luminal ER Ca2+concentration with targeted“cameleon”fluorescent proteins［J］.Cell Calcium，2003，34(2):109-19.

［24］Pryor P R，Mullock B M，Bright N A，et al.The role of intraorganellar Ca2+in late endosome-lysosome heterotypic fusion and in the reformation of lysosomes from hybrid organelles［J］.J Cell Biol，2000，149(5):1053-62.

［25］Saito M，Hanson P I，Schlesinger P.Luminal chloride-dependent activation of endosome calcium channels:patch clamp study of enlarged endosomes［J］.J Biol Chem，2007，282(37):27327-33.

［26］Christensen K A，Myers J T，Swanson J A.pH-dependent regulation of lysosomal calcium in macrophages［J］.J Cell Sci，2002，115(3):559-607.

［27］Galione A，Petersen O H.The NAADP receptor:new receptors or new regulation［J］?Mol Interventions，2005，5(2):73-9.

［28］Gerasimenko O，Gerasimenko J.New aspects of nuclear calcium signaling［J］.J Cell Sci，2004，117(15):3087-94.

［29］Gupta S，Singh R K，Nanda K，et al.Ratiometric Ca2+measurement in human recombinant muscarinic receptor subtypes using the Flexstation scanning fluorometer［J］.J Recept Signal Transduct Res，2009，29(2):100-6.

［30］Ruiz A，Matute C，Alberdi E.Endoplasmic reticulum Ca(2+)release through ryanodine and IP(3)receptors contributes to neuronal excitotoxicity［J］.Cell Calcium，2009，46(4):273-81.

［31］Bruce J I E，Giovannucci D R，Blinder G，et al，Modulation of［Ca2+］(i)signaling dynamics and metabolism by perinuclear mitochondria in mouse parotid acinar cells［J］.J Biol Chem，2004，279(13):12909-17.

［32］Ikeda M，Sugiyama T，Wallace C S，et al.Circadian dynamics of cytosolic and nuclear Ca2+in single suprachiasmatic nucleus neurons［J］.Neuron，2003，38(2):253-63.

［33］Truong K，Sawano A，Miyawaki A，et al.Calcium indicators based on calmodulin-fluorescent protein fusions［J］.Methods Mol Biol，2007，352(10):71-82.

［34］Nagai T，Sawano A，Park E S，et al.Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+［J］.Proc Natl Acad Sci，2001，98(6):3197-202.

［35］Frieden M，James D，Castelbou C，et al.Ca2+homeostasis during mitochondrial fragmentation and perinuclear clustering induced by hFis1［J］.J Biol Chem，2004，279(21):22704-14.